◎ 金周雨，丁 淼，康 驍，荊 波，高玉涵，國(guó) 微，宋 慧

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林北華大學(xué)理學(xué)院，吉林 吉林 132013）

海鮮菇隸屬擔(dān)子菌門(mén)層菌綱傘菌目白蘑科玉蕈屬，又被稱(chēng)為玉蕈、斑玉蕈、鴻喜菇、真姬菇等，是目前風(fēng)靡食用菌市場(chǎng)的珍稀菇種之一[1]，在日本享有“聞則松茸，食則玉蕈”的美譽(yù)。海鮮菇不僅質(zhì)地極為爽脆，而且味道也極為鮮美，近年來(lái)在日本被廣泛用作食品或調(diào)味品[2]。海鮮菇不僅含有對(duì)人體有益的黃酮和酚類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分，是一類(lèi)富含礦質(zhì)元素的低熱量、低脂肪、高蛋白的大型食用菌[3]，而且還具有抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等功效[4-5]。目前，在人工栽培和活性成分的鑒定是國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)海鮮菇研究的重要方面，而對(duì)海鮮菇主要營(yíng)養(yǎng)成分的利用和深度開(kāi)發(fā)比較欠缺。本實(shí)驗(yàn)選取海鮮菇為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化海鮮菇蛋白質(zhì)的提取條件，為海鮮菇進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

海鮮菇，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物所提供。

1.1.2 試劑及配制

①考馬斯亮藍(lán)G-250溶液?？捡R斯亮藍(lán)G-250粉末0.10 g精確稱(chēng)取于含有50 mL 95%乙醇的燒杯中，加入100 mL 85%磷酸試劑，充分溶解后加水定容至1000 mL，混勻過(guò)濾備用。②標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（0.1 mg·mL-1牛血清白蛋白）。精確稱(chēng)取牛血清蛋白25 mg，加蒸餾水充分溶解后定容至100 mL，吸取定容好的溶液40 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL即為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

以上所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器表

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取出6支試管，然后將試管分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6，再依次往試管中吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，加入蒸餾水至1.00 mL，然后加入5.00 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，振蕩混勻后，室溫條件下反應(yīng)5 min，于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度值，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.2 樣品提取液的蛋白質(zhì)含量測(cè)定

樣品提取液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法。蛋白質(zhì)提取含量按公式（1）的計(jì)算。

式（1）中，W0表示根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算的蛋白質(zhì)含量值，單位μg；VT表示提取液總體積，單位mL；W1表示樣品干重，g；VS表示測(cè)定時(shí)加樣量，mL。

1.3.3 計(jì)算海鮮菇蛋白質(zhì)提取率

通過(guò)凱式定氮法(GB 5009.5-2016)[6]測(cè)定樣品的總蛋白，按公式（2）計(jì)算海鮮菇蛋白質(zhì)提取率。

式（2）中，MK表示樣品提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量，單位mg；MZ表示樣品測(cè)得的總蛋白質(zhì)質(zhì)量，單位mg。

1.3.3.1 海鮮菇蛋白質(zhì)提取的單因素實(shí)驗(yàn)

（1）單因素實(shí)驗(yàn)中提取溫度的確定。在海鮮菇蛋白質(zhì)提取時(shí)間和提取料液比處理?xiàng)l件不變的條件下，選擇5個(gè)提取溫度，篩選不同提取溫度的蛋白質(zhì)提取率。即當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取時(shí)間為1.5 h，提取料液比為1∶60，提取溫度分別為70、75、80、85 ℃和90 ℃時(shí)，進(jìn)行海鮮菇蛋白質(zhì)提取條件篩選。

（2）單因素實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)間的確定。在海鮮菇蛋白質(zhì)提取料液比和提取溫度處理?xiàng)l件不變的條件下，選擇5個(gè)提取時(shí)間點(diǎn)，篩選不同提取時(shí)間下的蛋白質(zhì)提取率。即當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取料液比為1∶60，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.5 h和3.0 h時(shí)，進(jìn)行海鮮菇蛋白質(zhì)提取條件篩選。

（3）單因素實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)料液比的確定。在海鮮菇蛋白質(zhì)提取時(shí)間和提取溫度不變的條件下，選擇5個(gè)提取料液比不同比例，篩選不同提取料液比的蛋白質(zhì)提取率。即當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取的時(shí)間為1.0 h，提取溫度為80 ℃，提取料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70時(shí)，進(jìn)行海鮮菇蛋白質(zhì)提取條件篩選。

1.3.3.2 海鮮菇蛋白質(zhì)提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定正交試驗(yàn)的方法，以海鮮菇蛋白質(zhì)提取率為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)表，以進(jìn)一步對(duì)海鮮菇蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)各因素及水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 海鮮菇蛋白質(zhì)提取的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以蛋白質(zhì)含量（μg）作為橫坐標(biāo)，測(cè)得的吸光度（OD）值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為Y=0.006 4X+0.011 8，R2=0.997 1，式中Y為吸光度，X為蛋白含量（μg）。線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1 海鮮菇蛋白質(zhì)提取的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.2 單因素對(duì)海鮮菇蛋白質(zhì)提取含量的影響

2.2.1 海鮮菇蛋白質(zhì)提取條件中提取溫度的影響

當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取時(shí)間為1.5 h，提取料液比1∶60，提取溫度分別為70、75、80、85 ℃和90 ℃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)海鮮菇蛋白質(zhì)提取率的影響圖

由圖2可見(jiàn)，蛋白質(zhì)提取率伴隨著溫度的升高先升高后降低，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高。提取溫度提高可以改進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解性能，從而提高蛋白質(zhì)的提取率；另外，在考慮蛋白質(zhì)提取率的同時(shí)，也要兼顧蛋白質(zhì)的品質(zhì)，溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)會(huì)變性失活?；谶@樣的分析，蛋白質(zhì)提取溫度不易定得過(guò)高。當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取溫度是80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到2.135%。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)海鮮菇蛋白質(zhì)提取含量的影響

當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取料液比為1∶60，提取溫度80 ℃，時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)，海鮮菇蛋白質(zhì)的溶出是當(dāng)時(shí)間達(dá)到1.0 h時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高，而隨著時(shí)間延長(zhǎng)可能蛋白質(zhì)降解造成蛋白質(zhì)含量降低。當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取時(shí)間為1.0 h時(shí)，蛋白提取率達(dá)到3.118%。

2.2.3 提取料液比對(duì)海鮮菇蛋白質(zhì)提取含量的影響

當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取時(shí)間為1.0 h，提取溫度80 ℃，提取料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，海鮮菇蛋白質(zhì)提取率伴隨著溶液的增多先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高。隨著物料與溶液的接觸面的增加，易于蛋白質(zhì)溶出，而當(dāng)料液比大于1∶50時(shí)，蛋白質(zhì)提取率總體是下降的。當(dāng)海鮮菇蛋白質(zhì)提取料液比1∶50時(shí)，蛋白提取率達(dá)到3.950%。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化海鮮菇蛋白質(zhì)提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化海鮮菇蛋白質(zhì)熱水浸提條件。正交試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表3。

正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)是蛋白質(zhì)提取率。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，判斷工藝參數(shù)的影響大小為提取料液比（B）＞提取溫度（C）＞提取時(shí)間（A）。最佳的工藝條件為A2B3C2的條件，即加熱時(shí)間為1 h，海鮮菇粉與液體的比例為1∶60，提取溫度為80 ℃，在此條件下海鮮菇蛋白質(zhì)的提取率最大達(dá)到4.670%。

3 結(jié)論

①單因素實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)提取溫度80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高，達(dá)到2.135%。②單因素實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)提取時(shí)間為1 h時(shí)，蛋白提取率最高，達(dá)到3.118%。③單因素實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)提取料液比1∶50時(shí)，蛋白提取率最高，達(dá)到3.950%。④正交試驗(yàn)表明，海鮮菇蛋白質(zhì)提取最佳提條件為提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶60，提取溫度為80 ℃，在此條件下海鮮菇蛋白質(zhì)的提取率是4.670%。

4 討論

蛋白質(zhì)是生物活性物質(zhì)，在生物體中具有重要作用，是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源。在動(dòng)植物及菌類(lèi)中含有較高的蛋白質(zhì)成分。劉暢等[7]采用響應(yīng)面法對(duì)北五味子水溶性糖蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件是料液比1∶35（g·mL-1），堿提液pH為9.5，浸提溫度35 ℃，浸提時(shí)間3 h時(shí)，糖蛋白提取率最高。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)海鮮菇蛋白質(zhì)的提取以蛋白質(zhì)提取率為標(biāo)準(zhǔn)，所以在實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)中對(duì)溫度、pH的條件設(shè)計(jì)范圍比較寬。如果對(duì)蛋白質(zhì)活性要求較高，不僅考慮提取溶液的酸堿度，而且提取溫度不宜過(guò)高，否則可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其生物活性降低甚至破壞。