◎ 殷 歡，梁梅娟，蘇佩冰，陳靖欣

（中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437）

單核細胞增生李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）在自然界中廣泛分布，是一種食源性疾病的致病菌并能夠引起人畜共患病。在食品中存在的單增李斯特菌對人類的健康產(chǎn)生威脅，引起新生兒腦膜炎及成人敗血病等疾病。單增李斯特菌能夠在冷藏溫度下生長，在肉類、蔬菜水果、乳制品以及海產(chǎn)品等冷藏食品中檢出率較高，已成為食物保鮮中過程中存在的安全隱患[1]。美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）網(wǎng)站上陸續(xù)報道了從2011年7月31日出現(xiàn)首例單增李斯特菌病例報告至同年12月8日，感染人數(shù)多達147例，死亡33例[2]。2018年7月9日英國《每日郵報》報道，近期，歐洲李斯特氏菌感染爆發(fā)，一批被李斯特氏病菌污染的冰凍甜玉米已導(dǎo)致47人患病，其中9人死亡[3]。2018年11月22日，歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)（RASFF）發(fā)布4則涉及產(chǎn)品疑含李斯特菌的警示通報，產(chǎn)品為匈牙利的熏培根、奧地利的牛肉片、波蘭的熏挪威三文魚[4]。由單增李斯特菌導(dǎo)致的食源性疾病的爆發(fā)以及帶來的潛在風(fēng)險警示我們，在食品檢驗過程中準確快速檢出單增李斯特菌具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品編號為M228d02A、M228d02B，樣品狀態(tài)為密封瓶裝固體，樣品數(shù)量為2份。

1.2 實驗試劑

本次實驗所用的培養(yǎng)基、即用型血瓊脂平板、生化鑒定管套裝購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；李斯特顯色培養(yǎng)基由科瑪嘉公司生產(chǎn)。革蘭氏陽性細菌鑒定卡GP卡，AIPLAB軟件，APIListeria 10300試劑盒由法國生物梅里埃公司提供。全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（RiboPrinter）配套試劑由美國杜邦公司提供。

1.3 實驗儀器

全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact），購自法國生物梅里埃公司；RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)，購自美國杜邦公司；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽，購自上海博訊實業(yè)有限公司；SG603A-HE型生物安全柜，購自美國BAKER公司；拍打式均質(zhì)器，購自法國interscience公司；RCT Basic型磁力攪拌器和MS3基本型圓周振蕩器，均購自廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司；細菌鏡檢設(shè)備是日本奧林巴斯生產(chǎn)的CX41型生物顯微鏡；BD260型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自德國賓得公司； HVA-85型高壓滅菌器，購自日本Hirayama公司。

1.4 實驗方法

按照《雞肉中李斯特菌屬、單增李斯特菌檢驗（定性）能力驗證》樣品作業(yè)指導(dǎo)書的要求對樣品進行檢測前處理，并依據(jù)GB 4789.30-2016 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗進行增菌，分離，初篩以及鑒定。同時以APIListeria 10300試劑盒、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2- Compact）和全自動微生物基因指紋圖譜鑒定系統(tǒng)（RiboPrinter）進行菌種鑒定，最終綜合以上試驗結(jié)果報告。檢驗流程見圖1，同時以單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌作為陽性對照菌進行試驗。以英諾克李斯特氏菌作為陰性對照菌。

圖1 檢驗流程圖

1.4.1 樣品前處理

將20 mL BPW加入到每個樣品瓶中，輕輕顛倒幾次后靜置30 min使樣品瓶中雞肉液化。

1.4.2 檢樣

樣品瓶中液體全部轉(zhuǎn)移至225 mL LB1增菌液中，均質(zhì)后至于30 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。吸取0.1 mL樣品勻液加入到10 mL LB2增菌液中，至于30 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于36 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察各個平板上生長的菌落。記錄觀察24～48 h菌落的生長狀態(tài)。

1.4.3 初篩

自選擇性瓊脂平板上分別挑取3～5個典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管， 于36 ℃培養(yǎng)24 h，同時在TSA-YE平板上劃線，于36 ℃培養(yǎng)24 h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進行鑒定。

1.4.4 鑒定

根據(jù)GB 4789.30-2016中傳統(tǒng)鑒定方法的要求，對可疑菌株革蘭氏染色鏡檢、SIM培養(yǎng)基動力試驗、生化鑒定。主要包括木糖、鼠李糖、過氧化氫酶試驗、七葉苷試驗、甘露醇試驗、溶血試驗、協(xié)同溶血試驗、麥芽糖試驗、葡萄糖試驗、MR-VP試驗。

1.4.5 API法鑒定

按照產(chǎn)品說明書進行操作，36 ℃孵育24 h后取出。

1.4.6 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)(VITEK2-Compact)鑒定

分別從TSA平板上挑取單個菌落，制成符合儀器濁度的菌懸液。用GP鑒定卡，按照儀器操作規(guī)程，采用VITEK2-Compact菌種鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

1.4.7 全自動微生物基因指紋圖譜鑒定系統(tǒng)（RiboPrinter）鑒定

挑取新鮮菌落1～3個，懸浮于40 μL樣品緩沖液中， 混勻后吸取30μL于樣品杯中， 熱滅活后各加入5 μL裂解液A和裂解液B，放置于RiboPrinter 樣品孔中。運行程序，選用 EcoR I酶切系統(tǒng)。雜交圖譜選擇與DuPont ID數(shù)據(jù)庫進行比對，得出待測菌株信息。

2 結(jié)果與分析

國家標(biāo)準法中傳統(tǒng)鑒定方法作為標(biāo)準評價API法、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）和全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（RiboPrinter）。四種方法均能準確在編號為M228d02A 的樣品中檢出單增李斯特菌。API法、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）和全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（RiboPrinter）在培養(yǎng)和鑒定耗時方面有明顯優(yōu)勢。具體情況見表1。

表1 單增李斯特菌檢出過程表

3 討論

采用食品安全國家標(biāo)準方法中的傳統(tǒng)方法來檢測單增李斯特菌，分離鑒定方法較簡單但是操作繁瑣費時費力，一般需要5～7 d完成，難以滿足快速檢測的需求[5]。對于菌落的觀察、溶血試驗及協(xié)同溶血試驗等內(nèi)容對操作人員的能力有一定的考驗。同時傳統(tǒng)國家標(biāo)準法的生化鑒定管一般采用安瓿瓶，操作過程容易劃傷操作人員的手。API法通過制作菌懸液一次接種試劑條培養(yǎng)即可，培養(yǎng)后通過觀察自然反應(yīng)以及加入附加試劑的變色反應(yīng)來判定酶以及糖發(fā)酵產(chǎn)物的反應(yīng)結(jié)果。操作過程耗時較少、操作簡單安全。API法有效地彌補了傳統(tǒng)檢測方法中的不足之處，有效提高檢測時效及準確率，特別適合從事微生物檢驗工作初期的檢驗人員[6]。全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）和全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（RiboPrinter）在操作和鑒定用時方面有明顯優(yōu)勢，通過分離出的可疑菌株的純培養(yǎng)物進行快速鑒定。本試驗通過使用多種方法對可疑的典型菌落均做出了正確的判斷，方法之間可以互相佐證，為快速鑒定單增李斯特菌提供多種可行性。因此，API Listeria李斯特菌鑒定試劑盒、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）以及全自動微生物基因指紋圖譜鑒定系統(tǒng)（RiboPrinter）等越來越多自動化、系統(tǒng)化的方法被應(yīng)用在單增李斯特菌的檢測中。