米弘瑛 劉凱 許小艷 顧美琴 許小志 米思源

1云南省第一人民醫(yī)院兒科（昆明650032）；2昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院兒科（昆明650032）；3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院（廣州510080）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是一種以肺泡損傷為特征的疾病，目前仍是導(dǎo)致早產(chǎn)兒發(fā)病和死亡的主要原因［1］。BPD發(fā)病機(jī)制包括了遺傳易感性、氧中毒、氣壓傷、感染或炎癥等單一或多因素誘發(fā)［2］。機(jī)體內(nèi)活性氧水平上升，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷是其主要的病理學(xué)機(jī)制［3］。已有的研究指出遺傳因素是BPD發(fā)生的一項(xiàng)主要危險(xiǎn)因素，中-重度BPD的遺傳可能性是53%～79%［4］。在幾項(xiàng)系統(tǒng)性BPD的研究工作中，采用GWAS方法評估了數(shù)以百萬級的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），發(fā)現(xiàn)睪素2（SPOCK2）是大部分分析中均出現(xiàn)的BPD相關(guān)基因［5?9］。 這暗示了SPOCK2基因的SNP同BPD的相關(guān)性。已有的研究顯示SPCOK2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1245560和rs1049269在白種人和非洲新生兒中，與BPD的發(fā)病緊密關(guān)聯(lián)［10］。在我國，SPOCK2多態(tài)性與BPD的關(guān)聯(lián)性研究尚無報(bào)道，故本研究旨在探討二者間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年1?12月在云南省第一人民醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室（NICU）住院的56例患有BPD早產(chǎn)兒作為BPD組。納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）符合BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）出生后持續(xù)用氧＞28 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形、膈疝、呼吸系統(tǒng)畸形、嚴(yán)重先天性心臟病、染色體異常等致死性先天畸形者。另外選取同期入住本醫(yī)院的無肺部疾病的早產(chǎn)兒76例為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)，患兒家屬均知情同意并簽署同意書。

1.2 方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）測序方法檢測SPOCK2基因多態(tài)性。采集兩組患兒靜脈血2 mL至EDTA抗凝管中與-80℃冰箱備用。采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化，中國）提取DNA。SPOCK2引物序列為：rs1245560：上游引物：TTTTTCGGGTTGGGGTGGTC，下游引物：TTAAACCTTCCAGCACGCAC；rs1049269，上游引物AGCTGAGGAAGGACCGATCT，下游引物ATCAG?CCCTCTGCTCTCTGA。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s。72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至昆明碩擎生物公司進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用表示計(jì)量資料，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的差異；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；基因型頻率及等位基因頻率的分布情況進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，用Hardy?Weinberg遺傳平衡定律進(jìn)行等位基因確認(rèn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用多因素方差分析研究兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與BPD的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料兩組新生兒性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.263），可以排除該因素對結(jié)果的影響。BPD組新生兒在出生體質(zhì)量、孕周、通氣時(shí)間、氧療時(shí)間和住院時(shí)間上同對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01，表1）。BPD組新生兒Apgar評分（1 min）同對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.124），但Apgar評分（5 min）較對照組顯著降低（P＜0.01）。

表1 兩組臨床樣本資料的比較Tab.1 Comparison of the clinical demographics between the two groups±s

表1 兩組臨床樣本資料的比較Tab.1 Comparison of the clinical demographics between the two groups±s

臨床指標(biāo) 對照組（7 6例）B P D組（5 6例）P值性別（女/男）出生體質(zhì)量（k g）孕周A p g a r評分（1 m i n）A p g a r評分（5 m i n）機(jī)械通氣時(shí)間（d）氧療時(shí)間（d）住院時(shí)間（d）4 6/3 0 1.8 0 1±0.0 4 3 3 3.7 9 0±0.2 0 0 8.4 7 4±0.1 0 5 9.3 1 6±0.0 7 6 1.6 2 4±0.4 2 2 1 2.2 3 2±0.9 3 8 2 4.8 1 6±1.1 4 6 2 6/3 0 1.4 7 5±0.0 8 2 3 1.2 8 6±0.5 0 1 7.9 6 4±0.3 5 4 7.8 9 3±0.4 1 9 9.2 4 3±2.0 1 7 4 1.4 7 9±2.3 7 2 4 6.2 5 0±2.3 3 5 0.3 2 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.1 2 4 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.2 基因多態(tài)性分布本研究SPOCK2基因多態(tài)性分布的實(shí)際值和預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），符合Hardy?Weinberg平衡，說明研究群體具有代表性。

2.3 SPOCK2基因多態(tài)性在對照組和BPD組的分布情況圖1為SPOCK2基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的測序結(jié)果。其中rs1245560、rs1245561和rs1245562三個(gè)位點(diǎn)為完全連鎖。因此，本研究僅分析rs1245560和rs1049269兩個(gè)SNP的分布和BPD關(guān)聯(lián)性。

rs1245560位點(diǎn)對照組中AA、AC、CC的基因型頻率分別為28.9%、50.0%、21.1%。在BPD組中的AA、AC、CC的基因型頻率分別為21.4%、17.9%、60.7%。各個(gè)基因型在兩組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。兩組樣本中等位基因的頻率差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.803）。

rs1049269位點(diǎn)對照組中AA、AG、GG的基因型頻率分別為44.7%、23.7%、31.6%。在BPD組中的AA、AG、GG的基因型頻率分別為25.0%、32.1%、42.9%。AA基因型在對照組中的分布頻率和AG基因型在BPD組中的分布明顯高于比較組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039，表3）。G等位基因在BPD組的分布頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025）。

3 討論

圖1 SPOCK2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1049269、rs1245560、rs1245561和rs1245562的測序圖Fig.1 Gene sequencing analysis of rs1049269，rs1245560，rs1245561 and rs1245562

表2 兩組rs1245560位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布的比較Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequenciesof rs1245560 in BPD infants and controls

表3 兩組rs1049269位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布的比較Tab.3 Distribution of genotypic and allelic frequenciesof rs1049269 in BPD infants and controls

BPD是危及早產(chǎn)兒生命的嚴(yán)重疾病，許多風(fēng)險(xiǎn)因素共同作用誘發(fā)肺部病理改變，導(dǎo)致生理結(jié)構(gòu)異變，造成功能障礙［11］。一般認(rèn)為，出生體質(zhì)量501～750 g早產(chǎn)兒發(fā)病率高達(dá)52%。而應(yīng)用呼吸機(jī)且住院28 d以上的超低出生體質(zhì)量新生兒中BPD發(fā)生率為41.07%［12］。目前，常常將孕周、出院時(shí)間等作為BPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)了BPD新生兒在出生體質(zhì)量、孕周、Apgar評分（5 min）均低于對照組；同時(shí)機(jī)械通氣時(shí)間、氧療時(shí)間和住院天數(shù)均顯著提高，這也符合BPD患兒的臨床治療資料。需要注意的是，Apgar評分（1 min）在兩組新生兒中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。早期的諸多研究表明Apgar評分（1.5 min）是BPD的臨床指標(biāo)［13?15］；但現(xiàn)在也有研究［16?18］認(rèn)為Apgar評分（5 min）是BPD的高危因素，而Apgar評分（1 min）是極低出生體質(zhì)量患兒和重度BPD的風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究由于樣本規(guī)模、納入的極低出生體質(zhì)量或重度BPD患兒較少，因此Apgar評分（1 min）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

盡管各種治療手段能夠提高早產(chǎn)兒的存活率，但對于BPD的發(fā)病率無影響。BPD的發(fā)病受到諸多風(fēng)險(xiǎn)因素的影響，其中遺傳因素在BPD發(fā)病機(jī)制中超過50%。BHANDARI等［19］發(fā)現(xiàn)53%的BPD風(fēng)險(xiǎn)可歸納于遺傳因素。越來越多的研究強(qiáng)調(diào)了遺傳因素對BPD易感性的貢獻(xiàn)，如血管內(nèi)皮生長因子［20］、肺泡表面活性物質(zhì)蛋白［21?23］、谷胱甘肽S?轉(zhuǎn)移酶P1［24］、SPOCK2等。

SPOCK2（SPARC/骨粘連蛋白，CWCV和Kazal樣蛋白聚糖2）也被稱為睪丸蛋白聚糖（Testican?2），它是睪丸細(xì)胞外軟骨素和硫酸乙酰肝素蛋白多糖的成員。SPOCK2最初是從人類cDNA文庫中克隆而來［25］。大鼠體內(nèi)研究顯示SPOCK2在肺部表達(dá)，這暗示了其在肺部發(fā)育或相關(guān)疾病可能扮演重要角色［26］。HADCHOUEL等［10］最初利用DNA混樣對43例法國BPD患兒進(jìn)行了GWAS研究鑒認(rèn)出SPOCK2是BPD的一個(gè)遺傳易感基因。隨后該課題組進(jìn)一步在芬蘭嬰兒中確認(rèn)了SPOCK2基因上的 SNP（rs1245560）在白種人（P=0.02，OR=1.85）以及非洲人（P=0.007，OR=2.43）中同BPD的關(guān)聯(lián)性。本研究發(fā)現(xiàn)SPOCK2基因上的SNP位點(diǎn)rs1245560同昆明新生兒BPD發(fā)病率無關(guān)聯(lián)，此結(jié)果與WANG等［27］研究結(jié)果一致。為了系統(tǒng)性研究遺傳對極低出生體質(zhì)量嬰兒罹患中至重度BPD的影響，WANG等［27］對胎齡25～30周齡的單胎嬰兒全基因關(guān)聯(lián)研究，他們初步篩選到27個(gè)既往研究中發(fā)現(xiàn)的與BPD有關(guān)的SNPs，但在進(jìn)一步的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，這些SNPs均同BPD不相關(guān)，其中包括了SPOCK2基因的rs1245560位點(diǎn)和rs1049269位點(diǎn)。對于rs1049269位點(diǎn)同BPD的相關(guān)性，本研究結(jié)果顯示該位點(diǎn)的AG基因型同BPD發(fā)病相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)G等位基因頻率是BPD的高風(fēng)險(xiǎn)易感基因。HADCHOUEL等［10］發(fā)現(xiàn)rs1049269同BPD的關(guān)聯(lián)性只見于白種人群（P=0.025，OR=1.79），且這種關(guān)聯(lián)只在中至重度BDP患者中發(fā)現(xiàn)，而未見于輕度BPD。由于本研究納入的樣本規(guī)模較少，因此尚未進(jìn)行rs1049269同不同嚴(yán)重程度BPD的相關(guān)性分析，在未來的研究工作中將對此進(jìn)行深入開展。此外，Spock2的表達(dá)模式可能與肺發(fā)育和終止密切相關(guān)，可能是BPD患兒發(fā)病的機(jī)制。而rs1049269位于SPCOK2基因的3′UTR區(qū)域，據(jù)此推測，該位點(diǎn)可能通過影響某些miRNAs同SPCOK2的結(jié)合性進(jìn)而影響SPOCK2的表達(dá)水平，這仍需深入進(jìn)行研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SPOCK2多態(tài)性位點(diǎn)rs1245560同昆明地區(qū)早產(chǎn)兒BPD發(fā)病無相關(guān)性；rs1049269 AG基因型以及G等位基因是BPD患兒發(fā)病的高危易感因素。本研究對象是住院新生兒，同時(shí)由于BPD患兒樣本規(guī)模有限，臨床治療策略等可能對結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚。另外，國外的研究結(jié)論不盡相同，可能與不同人種的基因差異有關(guān)。本研究初步發(fā)現(xiàn)了SPOCK2基因rs1245560在BPD中的關(guān)聯(lián)性，但仍需要進(jìn)一步大樣本、多中心數(shù)據(jù)的支持。此外，也需針對SPOCK2進(jìn)行深入研究，以了解該基因在BPD中的作用機(jī)制，為BPD的基因治療提供理論基礎(chǔ)。