胡曉舒 常方方 徐小艷 馮智坤 溫一陽 楊金花

1鄭州人民醫(yī)院（鄭州 450000）；2河南醫(yī)學高等?？茖W校內(nèi)科（鄭州 450000）；3河南省人民醫(yī)院（鄭州 450000）

結直腸腺癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。近年來我國結直腸腺癌的發(fā)病率和病死率有所上升，分別居惡性腫瘤第4位及第5位，且呈逐年增加的趨勢［1］。且大部分患者就診時已處于結直腸腺癌中晚期，5年生存率不足50%，平均生存期也只有38～42個月，臨床生存期較短。因此，如何準確的判斷患者的病情，制定科學合理的治療方案，判斷患者的預后就顯得尤為重要。結直腸腺癌腫瘤標志物的檢測在某種程度上可以滿足這一訴求。

EZH2蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。p53是最早發(fā)現(xiàn)、最重要的抑癌基因，相關研究表明，野生型p53的突變是很多腫瘤發(fā)生的原因之一，p53突變與p53蛋白高表達有明顯的相關性。Ki?67是細胞核增殖指數(shù)的特異性指標，可以客觀地反映腫瘤細胞的增殖情況。有關EZH2、Ki?67、p53在結直腸腺癌中的單一指標的研究已見相關國內(nèi)外文獻報道，3個指標聯(lián)合研究在結直腸腺瘤及腺癌中的表達及相關性尚未見國內(nèi)外文獻報道。因此，本研究旨在通過免疫組化法聯(lián)合檢測EZH2、p53及Ki?67蛋白在結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常組織中的表達情況，結合患者的臨床病理因素，分析其相關性，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入標準：（1）經(jīng)兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師明確診斷；（2）首發(fā)、原發(fā)且無其他腫瘤，術前未經(jīng)任何放化療等輔助治療；（3）臨床病理資料完整；（4）無其他系統(tǒng)嚴重疾病者。收集2015年4月至2017年10月符合上述條件的，鄭州人民醫(yī)院普外科手術切除結直腸腺癌組織82例（結直腸腺癌組）、癌旁組織（距癌組織邊緣＞10 cm，即正常組）40例，消化內(nèi)科腸鏡下切除結直腸腺瘤組織49例（結直腸腺瘤組）。結直腸腺癌組：直腸癌37例，結腸癌45例；男46例，女36例；年齡42～78歲，平均年齡57±10.8歲；腫瘤分化程度高分化27例，中分化43例，低分化12例；有淋巴結轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結轉(zhuǎn)移43例；浸潤深度T15例，T227例，T325例，T425例；TNM分期Ⅰ期14例，Ⅱ期26例，Ⅲ期37例，Ⅳ期5例。結直腸腺瘤組：男26例，女23例；年齡38～70歲，平均（54±12.3）歲。正常組：男24例，女16例；年齡38～68歲，平均（52±14.1）歲。3組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 試劑與方法所有標本均經(jīng)4%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，3 μm連續(xù)切片。常規(guī)HE染色，觀察結直腸黏膜組織的病理形態(tài)。鼠單克隆抗體EZH2購自北京中杉金橋生物技術有限公司，鼠單克隆抗體P53、Ki?67及二抗購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化所有組織均經(jīng)石蠟包埋，每個石蠟塊5 mm連續(xù)切片，脫蠟至水；PBS洗3 min，兩次；抑制內(nèi)源性過氧化物酶，進行必要的抗原修復，PBS洗3 min，兩次；滴加第一抗體室溫2 h或4℃過夜，PBS洗3 min，兩次；滴加第二抗體酶復合物室溫20～30 min，PBS洗3 min，兩次；DAB顯色5～10 min；水洗終止顯色；復染細胞核；分化水洗、返藍水洗、脫水透明、封固。本研究中采用PBS代替一抗作為陰性對照，采用已知陽性片做陽性對照。

1.4 免疫組化結果判斷由病理科醫(yī)師進行雙盲法評測。EZH2、p53、Ki?67染色主要位于細胞核，呈棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)陽性細胞所占比例和陽性細胞胞核著色強度綜合判斷染色結果。低倍鏡下（×40）觀察著色強度：細胞未著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；高倍鏡下（×200）觀察陽性細胞所占比例：隨機觀察10個視野，每高倍視野計數(shù)100個瘤細胞，取其平均值得出陽性細胞的百分率，陽性細胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強度與陽性細胞數(shù)得分乘積＞4即為陽性，≤4即為陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。3 組間 EZH2、p53、Ki?67蛋白陽性表達率、結直腸腺癌組臨床病理特征蛋白陽性表達率的比較采用χ2檢驗，EZH2、p53、Ki?67蛋白之間的相關性檢驗用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常組織中EZH2、p53及Ki?67的陽性表達及比較82例結直腸腺癌組織中EZH2陽性表達66例，陽性率80.49%；p53陽性表達35例，陽性表達率42.68%；Ki?67陽性表達47例，陽性率57.31%。49例結直腸腺瘤組織中EZH2陽性表達20例，陽性率40.82%；p53陽性表達3例，陽性表達率6.12%；Ki?67陽性表達13例，陽性率26.53%。40例正常組織中EZH2陽性表達2例，陽性率5%；p53陽性率1.02%；Ki?67陽性表達1例，陽性率2.5%。結直腸腺癌組EZH2、p53及Ki?67的陽性表達率均明顯高于腺瘤組和正常組，其結果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖1、表1。

2.2 結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67的表達與臨床病理學特征的關系EZH2、p53及Ki?67的表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM分期有關，其差異具有統(tǒng)計學意義。即隨著腫瘤分化程度的降低，浸潤深度加深、淋巴結轉(zhuǎn)移，3種蛋白的表達明顯升高，TNM臨床分期晚期患者，蛋白的表達也明顯增強。EZH2、p53及Ki?67蛋白的陽性表達與患者的年齡和性別無相關性，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。82例結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67陽性表達患者與其臨床病理特征之間的關系，見表2。

圖1 EZH2、P53、Ki67在結直腸腺癌、腺瘤及正常腸粘膜的表達（IHC×200）Fig.1 The expression of EZH2，P53 and Ki?67 in colorectal adenocarcinoma，adenoma and nomal tissue

2.3 結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67表達的相關性EZH2與p53蛋白共同陽性32例，共同陰性13例，EZH2蛋白陽性而p53蛋白陰性34例，p53蛋白陽性而EZH2蛋白陰性3例，Spearman相關分析呈正相關（P＜ 0.05）。EZH2與Ki?67蛋白共同陽性45例，共同陰性13例，EZH2蛋白陽性而Ki?67蛋白陰性21例，Ki?67蛋白陽性而EZH2蛋白陰性2例，Spearman相關分析呈正相關（P＜0.05）。p53與Ki?67蛋白共同陽性30例，共同陰性30例，p53蛋白陽性而Ki?67蛋白陰性5例，Ki?67蛋白陽性而p53蛋白陰性17例，Spearman相關分析呈正相關（P＜ 0.05）。EZH2、p53及Ki?67蛋白在結直腸腺癌組織中呈現(xiàn)明顯的相關性。見表3。

表1 結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常組織中EZH2、p53及Ki?67的陽性表達及比較Tab.1 The comparison of EZH2,p53 and Ki?67 positive expression in colorectal adenocarcinoma，adenoma and nomal tissue

3 討 論

結直腸腺癌臨床發(fā)病率、病死率高，但治愈率卻不高，尤其結直腸腺癌的進展、侵襲和轉(zhuǎn)移是導致病人死亡的一大原因。結直腸腺癌是多因素作用、多基因參與、多階段調(diào)控的疾病，其發(fā)病機制尚不太清楚。

EZH2基因是PcG基因家族重要成員，PcG家族可使許多分化相關因子沉默，從而抑制細胞分化［2?3］。EZH2基因可明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移殖，使腫瘤細胞失控生長、過度增殖［4?5］。EZH2 基因在多種腫瘤中高表達，正常組織中不表達或少量表達，如血液系統(tǒng)腫瘤、黑色素腫瘤、膽管癌等。研究［6?8］報道，EZH2在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中的表達明顯高于前列腺癌原發(fā)灶的表達，且其高表達提示前列腺癌預后不良，EZH2在浸潤性乳腺導管癌中表達高于乳腺原位癌。CHEN等［9］研究也證實了EZH2的高表達可縮短結直腸癌患者的生存時間。本研究表明，EZH2基因在結直腸腺癌中表達水平明顯升高，遠遠高于正常組織，在結直腸腺瘤中中度表達，兩者之間亦有統(tǒng)計學差異。研究還發(fā)現(xiàn)，低分化的結直腸腺癌蛋白表達明顯高于中分化、高分化；有淋巴結轉(zhuǎn)移的蛋白表達率高于無淋巴結轉(zhuǎn)移組，TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期EZH2蛋白的陽性表達率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期，上述結果差異均具有統(tǒng)計學意義。這與張立成等［10］的研究報道相符。這表明EZH2蛋白的高表達在結直腸腺癌發(fā)生發(fā)展過程中有著非常重要作用，可用于結直腸腺癌高危人群的篩查，亦可以判斷結直腸腺癌的預后。

表2 結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67的表達與臨床病理學特征的關系Tab.2 The relationship with the expression and the clinical pathologic characteristics of EZH2，P53 and Ki?67 in colorectal adenocarcinoma例

表3 EZH2、p53及Ki?67蛋白在結直腸腺癌中表達的相關性Tab.3 The correlation of EZH2，p53 and Ki?67 expression in colorectal adenocarcinoma例

p53是非常重要的抑癌基因之一，一旦發(fā)生突變，可促進細胞惡性轉(zhuǎn)化，侵襲力增強，使得p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)樵┗颍?1?12］。免疫組化方法檢測出來多是突變型p53，野生型p53由于半衰期短、細胞中含量低而難以檢測到［13］。本實驗研究表明，p53在結直腸腺癌中陽性表達率明顯高于結直腸腺瘤和正常組織，進一步對臨床因素的各數(shù)據(jù)分析顯示，p53蛋白的陽性表達與TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移，浸潤深度、分化程度等密切相關，差異有統(tǒng)計學意義。說明p53蛋白的陽性表達率越高，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力越強。這與卞雪春等［14］研究結果一致。

Ki?67是具有代表性、應用廣泛的細胞增殖抗原之一，其功能與有絲分裂密切相關，在細胞周期各期中，其表達受到精準調(diào)控，與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移呈正相關［15?16］。本研究中顯示，Ki?67 在不同浸潤深度、不同分化程度的結直腸腺癌組織中的表達有統(tǒng)計學差異，且存在相關性，隨著淋巴結轉(zhuǎn)移、惡化程度越高、浸入的深入、分期越高，Ki?67的陽性表達越強。這證實，Ki?67亦與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，惡性細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關。孫旭凌等［17］臨床研究均也證實了這一結果。

研究證實，野生型p53激活后，可直接通過結合EZH2基因的啟動子抑制該基因的表達。當p53基因發(fā)生突變后喪失抑制作用，EZH2 表達則增加［18?19］。筆者的相關性分析結果表明，EZH2與p53表達在結直腸腺癌中呈正相關，這也提示EZH2蛋白在腫瘤中的表達受p53基因的調(diào)控。而EZH2、p53及Ki?67三者在結直腸腺癌中陽性表達也呈正相關，且隨著腫瘤分化程度的降低，浸潤深度加深、淋巴結轉(zhuǎn)移，3種蛋白的表達也明顯升高，推測3種蛋白在結直腸腺癌發(fā)展過程可能起協(xié)同作用。

綜上所述，聯(lián)合檢測EZH2、p53及Ki?67三者在結直腸腺癌中的表達情況，有助于了解腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學傾向，也可以為腫瘤的靶向及個體化治療提供依據(jù)，以期提高治療效果，延長患者的生存期。同時本研究僅用免疫組化得出上述結論尚不充分，因此有必要今后在分子水平上進一步探討。