祝麗瓊 陳慧 劉梅蘭 陳穎 王瞾華 魏菁 蘇芳 張建平

中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2醫(yī)學研究中心（廣州 510120）

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是常見的妊娠并發(fā)癥，指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上自然流產(chǎn)者。據(jù)統(tǒng)計，RSA的發(fā)病率約5%，它在生理和心理上對育齡婦女及其家庭產(chǎn)生諸多不良的影響，嚴重損害人類生殖健康。RSA的病因非常復雜，包括夫婦或胚胎染色體異常、代謝及內(nèi)分泌異常、感染，生殖道解剖異常、抗凝脂綜合征等［1］。但仍有一半以上患者病因不明，因此稱為“原因不明復發(fā)性流產(chǎn)”（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。生殖免疫學觀點認為，URSA的發(fā)生與母-胎免疫耐受異常有關［2］。近年來，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regula?tory T cell，Treg）在免疫耐受中的作用備受關注，Treg細胞在正常妊娠的維持中具有重要作用［3］。既往對Treg細胞的研究較多采用CD4+CD25+或CD4+CD25high作為其分子標志［4］，但這標記并不能真實反映Treg細胞水平。Foxp3又稱叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子，在Treg細胞中特異性表達，是Treg細胞特異性的分子標志。本研究采用CD4、CD25、Foxp3作為標記，采用三色流式細胞技術檢測并比較正常未孕及早孕，URSA患者未孕及稽留流產(chǎn)外周血中Treg細胞百分比，F(xiàn)oxp3 mRNA表達及血清中細胞因子TGF?β及IL?10的表達，以探討Treg細胞數(shù)量及其功能在URSA患者中的變化及其在妊娠維持中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2013年9月至2015年1月在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院就診，有連續(xù)3次或3次以上12周以前發(fā)生流產(chǎn)史的URSA稽留流產(chǎn)者及未孕患者各50例作為研究組，稽留流產(chǎn)患者在入組時均以陰道B超確診為早期妊娠稽留流產(chǎn)，且經(jīng)過系統(tǒng)流產(chǎn)病因篩查，排除夫婦染色體異常、內(nèi)分泌異常、解剖異常、感染及抗磷脂綜合征導致的流產(chǎn)；選取同期在人流室就診，要求進行人工流產(chǎn)的早期妊娠者25例及在體檢中心體檢的正常未孕婦女25例作為正常對照組，所有對照者以往至少有過一次正常足月分娩且無自然流產(chǎn)病史，正常早期妊娠者入組時均以B超確診為宮內(nèi)早孕，可見心管搏動。所有研究對象均沒有吸煙史、酗酒史、無糖尿病、高血壓、心臟病、肝腎疾病及血液疾病，3個月內(nèi)均無疫苗接種史。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑淋巴細胞分離液購自Sigma公司，流式抗體：CD4?FITC，CD25?APC、Foxp3?PE及PE同型對照單克隆抗、固定劑、破膜劑均購自BD Pharmigin公司。qRT?PCR引物由廣州吉賽生物技術有限公司設計合成。Trizol購自美國Invitrogen公司，Real?time PCR試劑購自盒日本TOYOBO公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司。細胞計數(shù)儀為Beck?man coulter（美國），PCR儀購自美國ABI公司，流式細胞儀購自BD公司（BD FACS Verse ?Z6511550198）。

1.2.2 分離外周血單個核細胞（peripheral bloodmononuclear cell，PBMC）本研究通過中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準，在征得研究對象的知情同意后，使用肝素鈉試管抽取靜脈血4 mL（研究組在行清宮前，對照組在做人工流產(chǎn)前）。取15 mL管離心管，每管小心加入淋巴細胞分離液4 mL，將4 mL外周血沿管壁緩慢置于淋巴細胞分離液層面之上，2 000 r/min 20℃離心20 min，收集淋巴細胞層中的淋巴細胞，PBS洗滌2次備用。

1.2.3 流式細胞技術檢查Treg百分比將PBMC調(diào)整至1×107/mL。取100 μL細胞懸液，向其中加入CD4?FITC，CD25?APC各10 μL，混勻，室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌離心后分別加入1 mL Fixation/Permeabilization破膜劑，室溫避光孵育40 min，用破膜緩沖液洗滌2次后，加入10 μL Foxp3?PE（同型對照管加入10 μL 小鼠IgG r1?PE），避光孵育30 min，經(jīng)破膜緩沖液洗滌2次，用500 μL PBS重懸，上流式機檢測。先以FSC?SSC設門淋巴細胞群（gate P1），再以CD4+T細胞設門（gate P2），分析CD4+T細胞中CD25+Foxp3+Treg細胞的百分比。

1.2.4 qRT?PCRFoxp3 和β?actin引物由廣州吉賽生物技術有限公司設計合成，序列如下：Foxp3?forward：5′?CATCCGCCACAACCTGAGTCTG?3′；Foxp3?reverse：5′?CCTGTTCGTCCATCCTCCTTT?CCT?3′；β?actin?forward：5′?GCACCACACCTTCTA?CAATGAGC?3′；β?actin?reverse：5′?GGATAGCA?CAGCCTGGATAGCAAC?3′。

取PBMC（2×106mL）按照說明書操作進行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在PCR儀上按以下反應條件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60 ℃ 30 s（此步驟收集熒光信號）；45個循環(huán)，融解曲線分析：溫度60～95℃。熒光實時定量PCR儀在設定相關參數(shù)后，測量出不同基因的cycle threshold（Ct值）。計算出ΔCt值及ΔΔCt。內(nèi)參β?actin及Foxp3擴增曲線及溶解曲線如圖1。

1.3 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計數(shù)據(jù)用Graph pad Prism v5.0 software軟件進行分析及作圖。計量資料結果以均數(shù)±標準差表示，兩組差異性比較采用t檢驗，相關性分析采用pearson相關分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象臨床基本情況比較URSA稽留流產(chǎn)組流產(chǎn)次數(shù)為3～5次；正常早孕組足月分娩次數(shù)均為1～2次；研究對象年齡、月經(jīng)周期，懷孕者孕周、BMI差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表1。

2.2 Treg/CD4+T百分比在URSA患者及正常對照中的表達流式細胞技術檢測Treg占外周CD4＋T細胞的百分比，結果顯示見圖2。正常早孕者Treg/CD4+T百分比較正常未孕者明顯增高［（7.38±1.48vs.（5.67± 0.94），P＜0.000 1］；URSA稽留流產(chǎn)者Treg/CD4+T百分比較URSA未孕者增高［（5.72± 1.00）vs.（5.26±1.08），P=0.03］；URSA稽留流產(chǎn)患者Treg/CD4+T百分比較正常早孕者明顯下降［（5.72±1.00）vs.（7.38±1.48），P＜0.000 1］；而URSA未孕組與正常未孕組相比Treg/CD4+T百分比差異無統(tǒng)計學意義［（5.26±1.08）vs.（5.68±0.94），P=0.1］

圖1 內(nèi)參β?actin及Foxp3擴增曲線及溶解曲線Fig.1 Amplification and dissolution curves of internal reference beta?actin and Foxp3

表1 研究對象臨床基本情況比較Tab.1 Comparison of the basic clinical situation of the subjects ±s

表1 研究對象臨床基本情況比較Tab.1 Comparison of the basic clinical situation of the subjects ±s

流產(chǎn)次數(shù)（次）足月分娩次數(shù)（次）年齡（歲）月經(jīng)周期（d）孕周（d）BMI（kg/m2）URSA未孕（n=50）3～4 0 28.08±2.78 29.67±2.34-20.78±1.58正常未孕（n=25）0 1～2 28.45±2.15 29.27±1.78-21.38±2.12 URSA稽留流產(chǎn)（n=50）3～5 0 28.35±1.87 30.58±2.45 44.14±5.83 20.14±2.53正常早孕（n=25）0 1～2 27.35±3.17 28.58±2.17 46.48±4.66 21.53±1.43

2.3 Foxp3 mRNA在URSA患者及正常對照中的表達以qRT?PCR測外周血PBMC中Foxp3 mRNA水平。結果見圖3。正常早孕者Foxp3 mRNA水平較正常未孕者明顯增高［（3.43±0.46）vs.（3.02±0.47），P=0.003］；URSA稽留流產(chǎn)者Foxp3 mRNA水平URSA未孕者增高［（3.06±0.57）vs.（2.79±0.52），P=0.01］；URSA稽留流產(chǎn)患者Foxp3 mRNA水平較正常早孕者明顯下降［（3.06±0.57）vs.（3.43±0.46），P=0.006］；而URSA未孕組與正常未孕組相比Foxp3 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義［（2.79±0.52）vs.（3.02±0.47），P=0.07］。

2.4 TGF?β及IL?10在URSA患者及正常對照中的表達以URSA稽留流產(chǎn)及正常早孕兩組為研究對象，以ELISA方法檢測兩組血清中Treg相關細胞因子TGF?β及IL?10的水平，結果見圖3。URSA稽留流產(chǎn)患者TGF?β及IL?10水平均較正常早孕者下降［TGF?β：（56.12± 11.25）vs.（50.12±9.78）ng/mL，P=0.02；IL ?10：（6.43±2.48）vs.（4.48± 2.12）pg/mL，P＜0.001］，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

1995年，SAKAGUCHI等［5］首次報道了在自身免疫耐受中存在一類表達IL2受體a鏈（IL2Ra，CD25）的T細胞亞群，并將這類CD4+CD25+T細胞命名為調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cell，Treg）。隨后研究發(fā)現(xiàn)，Treg是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞群，它能分泌IL?10、TGF?β，表達Foxp3及CTLA?4分子等，通過細胞間直接接觸或細胞因子間接方式抑制自身反應性T細胞的免疫反應、抑制傳統(tǒng)T細胞的活化以及促進一些抑制性細胞因子的分泌等，在維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、誘導移植物的耐受中發(fā)揮重要作用。近年來國內(nèi)外研究均證明Treg細胞在母胎免疫耐受中起著極其重要的作用［6］。

圖2 Treg/CD4+T百分比在URSA患者及正常對照中的表達Fig.2 Expression of Treg/CD4+T in URSA patients and normal controls

ZENCLUSSEN［7］首先證實正常妊娠小鼠胸腺中CD4+CD25+Treg細胞較非妊娠小鼠增高，有流產(chǎn)傾向的小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Treg細胞明顯降低，而向流產(chǎn)傾向小鼠轉(zhuǎn)入正常孕小鼠CD4+CD25+Treg細胞則可以阻止自然流產(chǎn)的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，有流產(chǎn)傾向的小鼠蛻膜組織中Foxp3表達降低。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)URSA患者CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量較正常對照組明顯下降［8］。上述研究均顯示，Treg細胞與妊娠失敗密切相關。本研究以CD4、CD25及Foxp3作為標記，利用流式細胞技術檢測Treg占外周CD4+T細胞的百分比，數(shù)據(jù)顯示：正常早孕者Treg/CD4+T百分比較正常未孕者明顯增高［（7.38±1.48）vs.（5.67±0.94），P＜0.000 1］；UR?SA稽留流產(chǎn)者Treg/CD4+T百分比較URSA未孕者增高［（5.72±1.00）vs.（5.26±1.08），P=0.03］；結果顯示，妊娠期母體外周Treg會顯著的升高，提示Treg細胞在維持妊娠中有重要作用。數(shù)據(jù)還顯示，URSA稽留流產(chǎn)患者Treg/CD4+T百分比較正常早孕者明顯下降［（5.72±1.00）vs.（7.38±1.48），P＜0.000 1］，結果提示，外周Treg細胞數(shù)量降低可能與URSA的發(fā)生密切相關。接下來筆者利用qRT?PCR技術檢測了Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp 3mRNA水平，在mRNA水平上證實了上述結果。

圖3 Foxp3 mRNA在URSA患者及正常對照中的表達Fig.3 Expression of Foxp3 mRNA in URSA patients and normal controls

圖4 TGF?β及IL?10在URSA患者及正常對照中的表達Fig.4 Expression of TGF?and IL?10 in URSA patients and normal controls

IL?10和TGF?β是兩種參與免疫調(diào)節(jié)及具有免疫抑制功能的細胞因子，而Treg細胞可通過釋放IL?10和TGF?β等抑制性細胞因子參與維持對機體免疫平衡［9-10］。研究表明，IL?10與TGF?β在母-胎免疫耐受中也起著非常重要作用。IL?10可以誘導滋養(yǎng)細胞及母胎界面單核細胞HLA?G基因和蛋白表達。IL?10還可以使單核細胞表面MHC?1型及Ⅱ型抗原表達降低。此外，IL?10還可以抑制Th1型細胞分泌Th1型細胞因子。有研究表明，IL?10水平降低可能與復發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病有關［11］。TGF?β具有較強的免疫抑制功能，它可以通過下調(diào)黏附分子從而抑制內(nèi)皮細胞上白細胞的附著，在移植物免疫耐受中起著非常重要的作用。此外，它還可以通過抑制T細胞增生，降低NK細胞毒性及效應性T細胞的活性，從而保護胚胎發(fā)育。有報道，妊娠期外周血單個核細胞表達TGF?β上調(diào)，參與維持正常妊娠，其表達下降與URSA發(fā)病有關［3］。本研究結果顯示：URSA稽留流產(chǎn)患者TGF?β及IL?10水平均較正常早孕者下降［TGF?β：（56.12±11.25）vs.（50.12±9.78）ng/mL，P=0.02；IL?10：（6.43±2.48）vs.（4.48±2.12），P＜0.001］，說明Treg細胞的數(shù)量減少，TGF?β及IL?10表達降低，與URSA的發(fā)生有密切關系。

綜上所述，Treg在維持妊娠中有重要作用；外周血Treg細胞數(shù)量及mRNA表達明顯降低，TGF?β及IL?10表達降低可能與URSA的發(fā)生有密切關系。