李顯永 官潤云 柯坤彬 顧鵬 李同海 崔慶鵬 陳印 趙暉

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明 650032）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）占據(jù)全球男性惡性腫瘤發(fā)病率第二位［1］。據(jù)估計(jì)，2018年全美將新增164 690例PCa，占男性新發(fā)腫瘤的19%［2］。我國PCa已是70歲以上人群致死率最高的泌尿系腫瘤，且其致死率正逐年上升，嚴(yán)重影響男性健康［3］。因此，對(duì)PCa發(fā)生、發(fā)展及診治策略的深入研究迫在眉睫。近年研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。N6?甲基腺苷（m6A）是指發(fā)生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾。它是真核生物mRNA中一種高豐度表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)修飾，據(jù)報(bào)道，人類有近7 600種mRNA以及超過300個(gè)非編碼RNA存在m6A修飾［4］。最新研究揭示m6A是一種動(dòng)態(tài)可逆的RNA甲基化修飾，由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（METTL3、WTAP、MET?TL14），去甲基酶（FTO、ALKBH5），相應(yīng)的閱讀蛋白（YTHDF、YTHDC）等協(xié)同調(diào)控［5］。METTL3作為催化RNA m6A修飾形成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體成員之一，目前已被證實(shí)在肺癌、肝癌和白血病等腫瘤疾病中呈高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)METTL3促進(jìn)了腫瘤相關(guān)癌基因的翻譯，影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展［6-8］。而MET?TL3在PCa中的表達(dá)水平及其作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過TCGA數(shù)據(jù)集資料分析并運(yùn)用Westren blot、IHC技術(shù)，從mRNA和蛋白水平來研究METTL3在PCa中的表達(dá)情況，并探索其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料本實(shí)驗(yàn)調(diào)取2014年4月至2018年1月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科PCa蠟塊32例和癌旁良性組織蠟塊29例，制作為厚度4 μm的連續(xù)切片，用于IHC檢測。其中年齡59～81歲，平均（66.09±5.49）歲；據(jù)2010年AJCC前列腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，T1～T2期21例，T3～T4期11例；N0期27例，N1期5例；Gleason評(píng)分 ≤ 7分22例，＞7分10例。收集2018年2-4月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行腹腔鏡下前列腺癌根治術(shù)切除的5例新鮮PCa和配對(duì)癌旁良性組織標(biāo)本，依次編號(hào)為T1～T5，N1～N5，標(biāo)本離體后迅速置入-80℃冰箱保存，用于Westren blot檢測。實(shí)驗(yàn)前所有標(biāo)本均由我院病理科HE染色證實(shí)為癌或癌旁良性組織；患者術(shù)前無長期內(nèi)分泌治療及放化療史；并排除合并其他惡性腫瘤、免疫疾病、代謝疾病以及臨床資料不全者。于 TCGA 數(shù)據(jù)集（https：//portal.gdc.cancer.gov/proj?ects）下載PCa的mRNA數(shù)據(jù)和匹配的臨床資料，從中納入各項(xiàng)資料齊全的417例PCa以及52例配對(duì)癌旁的數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)主要材料包括：DAB免疫組織化學(xué)顯色試劑盒（BBI）；兔抗人METTL3單克隆抗體（Abcam，英國）；HRP標(biāo)記的兔二抗（BBI）；PBS（BBI）；兔抗beta?action多克隆抗體（Abcam，英國）；Tween?20（BBI）；蛋白提取試劑盒（上海生工）；BCA試劑盒（上海生工）；PVDF膜（廣州譽(yù)維生物）；發(fā)光試劑盒（上海生工）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化學(xué)方法所有切片依次行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；檸檬酸三鈉抗原修復(fù)液，高壓鍋保壓4 min，冷卻至室溫，后PBS洗3次，各3 min；3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，后PBS洗3次，各3 min；6%正常山羊血清，室溫封閉30 min；加兔抗人METTL3單克隆抗體（稀釋濃度1∶500），4°C濕盒中孵育過夜，后PBS洗3次，各3 min；加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育45 min，PBS洗4次，每次3 min；DAB顯色，顯微鏡下觀察控制染色時(shí)間，蒸餾水終止顯色；蘇木素復(fù)染5 min，1%的鹽酸酒精分化，PBST洗返藍(lán)；常規(guī)脫水、透明、封片；顯微鏡采圖。使用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，按抗體說明書選用人膀胱癌組織作陽性對(duì)照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果分析METTL3蛋白以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色染色為陽性表達(dá)。所有切片在同一條件下隨機(jī)選取3個(gè)視野采圖。圖片使用image?pro?plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）作免疫組化結(jié)果半定量分析［9-10］，圖片選擇腺體區(qū)域（排除間質(zhì)和腺腔部分）測積分光密度（IOD）及面積（area），以平均光密度值（IOD/area，AOD）表示單位面積陽性程度，3個(gè)視野的平均AOD值代表METTL3蛋白的表達(dá)水平。

1.4 Western blot檢測取大約30 mg組織，加200 μL RIPA裂解液，低溫高速勻漿10 s，共3次，冰上裂解2 h，高速離心，吸取上清。二奎琳甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，最終將濃度調(diào)整為5 μg/μL，加入5×的上樣緩沖液，沸水浴10 min變性。配制12%的分離膠，5%的濃縮膠。電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%的BSA?TBST封閉。分別與抗METTL3抗體（1∶1 000）和抗 β?action（1∶1 000）抗體溫室孵育15 min，4℃過夜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫 40 min。TBST洗膜5次，各3 min。加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑顯影3～5 min。曝光，定影，拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件作數(shù)據(jù)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較采用配對(duì)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 METTL3 mRNA在PCa和癌旁表達(dá)的差異TCGA數(shù)據(jù)集中52例PCa的METTL3 mRNA表達(dá)明顯高于配對(duì)癌旁組織［（7.718±2.151）vs.（5.700± 1.385）］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.257，P＜0.01），見圖1。

圖1 52例PCa和配對(duì)癌旁組織METTL3 mRNA表達(dá)情況Fig.1 Expression of METTL3 mRNA in 52 cases of prostate cancer and adjacent tissues

2.2 METTL3蛋白在PCa和癌旁表達(dá)的差異IHC結(jié)果表明PCa和癌旁組織中METTL3蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中少量表達(dá)。METTL3蛋白在PCa組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁良性組織［0.074± 0.055）vs.（0.026±0.018）］，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.655，P＜ 0.01），見圖2。Western blot結(jié)果顯示METTL3蛋白在PCa中表達(dá) 量明顯高于配對(duì)癌旁良性組織，見圖3。

圖2 METTL3蛋白在不同組織中的表達(dá)情況Fig.2 Expression of METTL3 protein in different tissues

圖3 5例PCa和配對(duì)癌旁組織METTL3蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Expression of METTL3 protein in 5 cases of prostate cancer and adjacent tissues

2.3 METTL3 mRNA和蛋白在PCa中表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，METTL3 mRNA表達(dá)水平與PCa的Gleason評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.195，P＜0.01），而與年齡、T分期和N分期無相關(guān)性（P＞0.05），見表1；METTL3蛋白表達(dá)水平跟PCa的PSA值、Gleason評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.381，P＜0.05；r=0.449P＜0.01），而與年齡、T分期、N分期無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

3 討論

METTL3最早是從Hela細(xì)胞裂解液中鑒定出的一個(gè)70 kDa的蛋白［11］，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)其包含結(jié)合S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和催化m6A形成的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，具有獨(dú)立催化RNA的m6A修飾形成的活性［12］。近期研究表明METTL3還可以與MET?TL4結(jié)合形成異質(zhì)二聚體［13］，WTAP促進(jìn)其在核斑點(diǎn)的定位，使其催化活性大大提升［14］。m6A是目前發(fā)現(xiàn)的100多種RNA轉(zhuǎn)錄后修飾中豐度最高的修飾方式［15-16］。m6A修飾在RNA中的定位主要存在Rm6ACH（R=G或A，H=A、C或U）這一共有序列［13］，運(yùn)用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)m6A峰分布在mRNA 的 3′非翻譯區(qū)（3′UTR）、5′非編碼區(qū)（5′UTR），內(nèi)部外顯子、翻譯起始和終止密碼子附近區(qū)域［17-18］，鑒于其分布，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)m6A可能對(duì)mRNA的剪切、3′端的加工、mRNA的出核，翻譯效率、mRNA的衰退以及對(duì)miRNA的加工發(fā)揮重要作用，從而影響多種生物學(xué)功能，包括：DNA損傷修復(fù)、晝夜節(jié)律、組織發(fā)育、性別的決定和腫瘤的發(fā)生［5，19］。

表1 TCGA PCa數(shù)據(jù)集METTL3 mRNA的表達(dá)與PCa臨床病理特征的相關(guān)性分析Tab.1 The relationship between the expression of METTL3 mRNA and clinical characteristics of prostate cancer in TCGA PCa dataset±s

表1 TCGA PCa數(shù)據(jù)集METTL3 mRNA的表達(dá)與PCa臨床病理特征的相關(guān)性分析Tab.1 The relationship between the expression of METTL3 mRNA and clinical characteristics of prostate cancer in TCGA PCa dataset±s

注：**在置信度（雙側(cè)）為0.01時(shí)，相關(guān)性是顯著的

P值例數(shù)METTL3 mRNA表達(dá)水平r值294 123特征年齡≤65歲＞65歲Gleason評(píng)分≤7≥8 T分期T1～T2 T3～T4 N分期8.486±2.608 8.596±2.269 0.0220.650 228 189 8.056±2.627 9.076±2.244 0.1950.000**143 274 8.331±2.416 8.616±2.557 0.0490.314 0.0570.242 N0 N1 339 78 8.450±2.514 8.815±2.489

表2 METTL3蛋白的表達(dá)與PCa臨床病理特征的相關(guān)性分析Tab.2 The relationship between the expression of METTL3 protein and clinical characteristics in prostate cancer±s

表2 METTL3蛋白的表達(dá)與PCa臨床病理特征的相關(guān)性分析Tab.2 The relationship between the expression of METTL3 protein and clinical characteristics in prostate cancer±s

注：*在置信度（雙側(cè)）為0.05時(shí)，相關(guān)性是顯著的；**在置信度（雙側(cè)）為0.01時(shí)，相關(guān)性是顯著的。PSA：前列腺特異性抗原。Gleason評(píng)分：PCa病理分級(jí)使用的評(píng)分系統(tǒng)

特征年齡≤65歲＞65歲Gleason評(píng)分≤7≥8 PSA≤20 ng/mL＞20 ng/mL T分期T1～T2 T3～T4 N分期例數(shù)METTL3蛋白表達(dá)水平AOD值r值P值18 14 0.080±0.045 0.065±0.066-0.1660.363 22 10 0.061±0.043 0.102±0.068 0.3810.031*21 11 0.064±0.048 0.091±0.064 0.4490.010**21 11 0.063±0.051 0.094±0.058 0.2290.096 N0 N1 27 5 0.079±0.057 0.043±0.023-0.2280.209

METTL3在惡性腫瘤中扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCa組織中METTL3的mRNA和蛋白水平均明顯高于癌旁良性組織，且METTL3蛋白在前列腺細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。LIN等［17］在肺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)METTL3表達(dá)上調(diào)，并在人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞核和胞質(zhì)裂解液中分別檢測到METTL3蛋白的表達(dá)，而其他甲基催化酶則只在細(xì)胞核中檢測到表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。該研究還運(yùn)用meRIP?Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)人肺癌細(xì)胞系中癌基因EGFR、TAZ、MAPKAPK2（MK2）和DNMT3A的終止密碼子附近存在一個(gè)或多個(gè)m6A峰；敲低METTL3后，相關(guān)癌基因mRNA的m6A修飾水平下降，其蛋白水平也明顯下降；進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)METTL3也可以獨(dú)立于其他m6A修飾酶招募翻譯起始因子eIF3來促進(jìn)目的基因的翻譯。在白血病的研究中也表明，METTL3呈高表達(dá)，并促進(jìn)了c?MYC、BCL2和PTEN癌基因的翻譯，維持急性髓系白血病的增殖［8］。CAI等［20］在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)上調(diào) METTL3 可使腫瘤相關(guān)蛋白HBXIP的mRNA m6A修飾豐度增加，從而使其蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和生長，沉默METTL3后有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡。然而，在宮頸癌和腎癌中METTL3呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可有效抑制腫瘤進(jìn)展，表現(xiàn)出腫瘤抑制因子的角色［21-22］。由此可見METTL3在不同腫瘤中發(fā)揮著促癌或者抑癌的雙重作用，筆者推測METTL3在PCa中發(fā)揮促癌的作用，高表達(dá)的METTL3可能促進(jìn)了PCa某些癌基因的翻譯，從而影響PCa的發(fā)生和發(fā)展。

METTL3催化mRNA的m6A修飾形成，影響著多種生物進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCa中METTL3 mRNA和蛋白的水平與Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，即METTL3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平與PCa細(xì)胞分化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。VU等［23］在急性髓系白血病中得出相似的結(jié)論，高表達(dá)的METTL3抑制了骨髓造血干細(xì)胞的分化，敲低METTL3后急性髓系白血病細(xì)胞周期停滯，有效地促進(jìn)造血干細(xì)胞的分化。METTL3催化的mRNA m6A修飾還可以調(diào)節(jié)精原細(xì)胞的分化，促進(jìn)精子成熟［24］。LI等［25］研究還發(fā)現(xiàn)m6A修飾影響了T細(xì)胞在體內(nèi)的平衡和分化，這也暗示m6A修飾可能參與了腫瘤的免疫調(diào)節(jié)。此外，在胰腺癌的治療研究中發(fā)現(xiàn)，敲低METTL3后，癌細(xì)胞對(duì)化療藥物：吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑和放療具有更高的敏感性［26］，這也提示METTL3可能是腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

PCa的診療中，PSA被作為一項(xiàng)有效的臨床篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)METTL3蛋白的表達(dá)水平與PSA值呈正相關(guān)關(guān)系，結(jié)合METTL3與多種腫瘤的相關(guān)性，提示METTL3具有與PSA聯(lián)合作為PCa診斷標(biāo)記物的潛能。

綜上所述，本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集資料分析并運(yùn)用Western blot、IHC技術(shù)，從mRNA、蛋白水平證明METTL3在PCa中呈高表達(dá)，其蛋白表達(dá)主要定位在前列腺細(xì)胞核，胞質(zhì)少量表達(dá)，METTL3表達(dá)水平與Gleason評(píng)分和PSA值呈正相關(guān)。因而我們推測高表達(dá)的METTL3可能調(diào)控某些癌基因的翻譯，促進(jìn)PCa的發(fā)生、發(fā)展，影響PCa細(xì)胞的分化，同時(shí)可能與PSA聯(lián)合作為PCa的診斷標(biāo)記物。本課題組后續(xù)將擴(kuò)大樣本量研究，繼續(xù)探討METTL3在PCa中的表達(dá)及臨床意義，并結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述其在PCa可能的機(jī)制以及與其他m6A修飾酶的相互關(guān)系。