鐘霞 潘建華 童堅(jiān)

1海口市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（?？?570208）；2海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科（?？?570102）

單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV?1）是一種分布廣泛，易引起人群感染的病原體。其轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白質(zhì)根據(jù)功能可分為“必需蛋白”（對(duì)病毒基因表達(dá)、DNA合成和病毒顆粒組裝必不可少的蛋白質(zhì)）和“非必需蛋白”（允許病毒在各種極端條件下仍保持病毒性）［1］。US11是“非必需”病毒包膜蛋白之一，存在于感染細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，卻對(duì)HSV?1病毒在熱應(yīng)激或熱休克處理過的細(xì)胞中的存活起著至關(guān)重要作用［2］。作為一種RNA結(jié)合蛋白，US11識(shí)別結(jié)合序列和構(gòu)象特異的RNA，從而在基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用。同時(shí)，US11還可直接與宿主蛋白相互作用，從而達(dá)到抵抗宿主防御功能的作用。

目前盡管確定了US11能和宿主蛋白：核蛋白、蛋白激酶2和蛋白激酶R相互作用，但對(duì)這種相互作用的認(rèn)識(shí)還處在初級(jí)階段［3］。研究發(fā)現(xiàn)與病毒蛋白相互作用的宿主蛋白對(duì)了解病毒感染過程中發(fā)生的生化反應(yīng)，以及抗病毒的治療研究有重要的意義。而在先前的研究中，顯示經(jīng)綠熒光蛋白（GFP）標(biāo)記US11的HSV?1 KOS病毒株用于感染人包皮成纖維細(xì)胞（HFF）細(xì)胞具有與未標(biāo)記野生型菌株［4］相當(dāng)?shù)母腥拘院偷味龋▓D1）。基于此，本研究采用熒光標(biāo)記的HSV?1病毒感染人成纖維細(xì)胞（HFF），結(jié)合免疫共沉淀（co?immunoprecipitation，IP）對(duì)US11及其相互作用蛋白提取和純化，并聯(lián)合質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）法、蛋白質(zhì)印跡（Western blot）篩查、鑒定與US11蛋白存在相互作用的宿主候選蛋白，幫助更深入地解析US11的生物學(xué)功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

圖1 GFP標(biāo)記US11的病毒基因組位點(diǎn)示意圖Fig.1 Schematic of viral genome locus where US11 was tagged with GFP

1.1 抗體和試劑琥珀酰亞胺基辛二酸酯（suberic acid bis?N?hydroxysuccinimide ester，DSS）、蛋白 A珠、Triton X?100和蛋白酶抑制劑混合物，EDTA、ECL蛋白質(zhì)印跡底物和BCA蛋白質(zhì)測定試劑均購自美國Sigma公司。PBS和MOPS SDS運(yùn)行緩沖液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。兔抗US11多克隆抗體購自Santa Cruz公司。Tris?HCl（pH 7.4），兔血清，抗兔IgG過氧化物酶二抗購自艾美捷科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、病毒株和感染HSV?1 KOS菌株（由海南醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)）在其N?末端用GFP標(biāo)記US11，在天然啟動(dòng)子作用下，具有相當(dāng)于野生型菌株的表達(dá)水平。使用HSV?1菌株17作為對(duì)照，以確定US?11（GFP）在細(xì)胞中的定位。KOS菌株和菌株17均為野生型HSV?1，已被廣泛地用來研究HSV?1的復(fù)制、基因表達(dá)和致病機(jī)制。兩者對(duì)于HFF細(xì)胞的感染率相似，但前者的病原性小于后者。對(duì)在DMEM培養(yǎng)基中生長的HFF人包皮成纖維細(xì)胞（由本實(shí)驗(yàn)室保存）進(jìn)行感染來繁殖病毒原種，以MOI=5 pfu/mL進(jìn)行細(xì)胞感染，將感染后的細(xì)胞培養(yǎng)72 h，通過刮取培養(yǎng)基而收獲。將收集的細(xì)胞凍融并超聲處理以從細(xì)胞質(zhì)中釋放病毒顆粒。使用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）評(píng)估穩(wěn)定細(xì)胞系中US11的表達(dá)水平。

1.3 免疫共沉淀（IP）使用GFP?US11 HSV?1或?qū)φ站旮腥綡FF細(xì)胞，并使用抗GFP綴合的磁珠，在培養(yǎng)72 h后刮下細(xì)胞收集于硫酸葡聚糖鈉鹽（DSS）中，加入Triton X?100和蛋白酶抑制劑混合物，離心后取100 μL細(xì)胞沉淀懸浮，然后逐滴液氮冷凍，研磨混勻，每個(gè)樣品總共回收0.8 g冷凍細(xì)胞粉末，加入含有20 mmol/L HEPES?KOH、0.1 mmol/L醋酸鉀、2 mmol/L MgCl2、0.1% 吐溫-20、1 μmol/L ZnCl2、1 μmol/L CaCl2、250 mmol/L NaCl和1%Triton X?100和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液。將兔抗US11多克隆抗體與蛋白A珠在4℃溫度下孵育1 h，然后用抗體偶聯(lián)珠對(duì)US11及其相互作用蛋白提取純化，用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot分析樣品凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并在含有5%牛奶、0.1%吐溫20、50 mmol/L Tris和150 mmol/L NaCl的緩沖液中封閉1 h，與一抗（1∶1 000）在4℃溫度下孵育過夜，然后二抗室溫下孵育1 h。再將印跡與ECL檢測試劑一起溫育5 min，使用ECL使蛋白質(zhì)可視化。平行分析正常IgG對(duì)照樣品以區(qū)分非特異性結(jié)合蛋白。

1.5 質(zhì)譜分析（MS）將洗脫的樣品加載到Nu?PAGE 4?12%Bis?Tris凝膠上，凝膠以藍(lán)考馬斯染料染色，切片在50 mmol/L碳酸氫銨、50%乙腈中脫色，然后進(jìn)行三輪脫水和再水化步驟。樣品與12.5 ng/μL測序級(jí)胰蛋白酶在37℃下孵育過夜。將50%乙腈/0.5%甲酸溶液加入到凝膠片中并在室溫下溫育4 h提取肽。通過nLC?MS/MS對(duì)樣品分析，儀器為LTQ?Orbitrap Velos ETD質(zhì)譜儀偶聯(lián)Dionex Ultimate 3000 RSLC（美國Thermo公司）。將肽加載在捕獲柱（Magic C18 AQ，3 μm，100 μm×2.5 cm；美國Bruker公司）上，以0.5%三氟乙酸-1%乙腈-98.5%水作為流動(dòng)相，以5 μL/min流速脫鹽5 min，用反相色譜（Acclaim PepMap RSLC C18，1.8 μm，75 μm×25 cm）以 250 nL/min流速分離 120 min。質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)相關(guān)采集模式下運(yùn)行，在LTQ?XL離子阱中獲得10個(gè)數(shù)據(jù)相關(guān)的最強(qiáng)烈離子的MS/MS譜圖，標(biāo)準(zhǔn)化能量為35。對(duì)已經(jīng)破碎的前體離子動(dòng)態(tài)排除，參數(shù)包括：排除時(shí)間180 s，重復(fù)計(jì)數(shù)1，重復(fù)持續(xù)時(shí)間30 s，排除質(zhì)量寬度10 ppm，排除大小500。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過Proteome Discoverer（版本1.3；美國Thermo公司）處理含有每種生物樣品的MS/MS譜圖的原始文件，對(duì)UniProt、SwissProt序列數(shù)據(jù)庫（包含人類、皰疹病毒和污染物等132 670個(gè)序列）進(jìn)行檢索。使用以下參數(shù)搜索從正向和反向蛋白質(zhì)序列條目產(chǎn)生的肽數(shù)據(jù)庫的譜：最多兩個(gè)缺失的裂解，完整的酶特異性，固定修飾氨基甲酰甲基半胱氨酸（+57 Da），可變乙?；嚢彼幔?42 Da）和甲硫氨酸氧化修飾（+16 Da）。肽和蛋白質(zhì)概率通過Peptide Prophet和Protein Prophet算法計(jì)算。為了將假陽性鑒定減少至＜1%，概率過濾器設(shè)定為至少一個(gè)生物樣品中的每個(gè)蛋白質(zhì)具有99%的蛋白質(zhì)置信度，95%的肽置信度和兩個(gè)獨(dú)特的肽。將蛋白質(zhì)組和未加權(quán)的光譜計(jì)數(shù)輸出到 Excel［5-6］。

2 結(jié)果

2.1 GFP?US11 HSV?1感染HFF細(xì)胞使用共聚焦免疫熒光法，GFP標(biāo)記用于觀察感染后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)US11的位置。GFP?US11僅在感染后12 h定位于細(xì)胞核，呈離散點(diǎn)滴狀分布（圖2）。US11的核定位預(yù)計(jì)在感染階段。在感染后16 h時(shí)，US11仍然位于細(xì)胞核，在20 h時(shí)，US11從細(xì)胞核初始流出到細(xì)胞質(zhì)中，并且在24 h時(shí)，其顯現(xiàn)遍布于細(xì)胞質(zhì)。

圖2 GFP?US11 HSV?1在感染包皮成纖維細(xì)胞（HFF）后四個(gè)不同時(shí)間的位置Fig.2 Localization of GFP?US11 at four different hours with HSV?1 in primary human foreskin fibroblasts（HFF）

2.2 HFF細(xì)胞核中與US11相互作用的蛋白在使用或不使用交聯(lián)劑進(jìn)行共IP實(shí)驗(yàn)后，通過West?ern Blot分析評(píng)估分離的有效性。如預(yù)期那樣，沒有DSS交聯(lián)，在IP樣品中檢測到重鏈和輕鏈以及IgG片段。DSS的使用完全消除了抗體污染（圖3A），表明US11抗體通過DSS交聯(lián)成功固定在蛋白質(zhì)A珠上。

對(duì)固定化抗體孵育裂解物后流通部分中的US11（即未結(jié)合的US11）評(píng)估，顯示在流通級(jí)分中檢測到DSS交聯(lián)和不存在DSS交聯(lián)的未結(jié)合US11相當(dāng)（圖3B，第三和第四泳道），提示本研究使用的DSS濃度進(jìn)行固定不會(huì)明顯改變US11的抗原結(jié)合能力。

2.3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferas?es 3A，DNMT3A）是一種新型的US11相互作用蛋白在感染后16 h時(shí)與GFP?US11共分離出幾種潛在宿主蛋白質(zhì)（表1）。用GFP?US11 HSV1感染這些細(xì)胞，通過標(biāo)記分離DNMT3A，利用Western blot分析，觀察見GFP?US11與DNMT3A共分離，但與IgG控制無關(guān)（圖4A）。用野生型HSV?1感染DMNT3A?GFP?FLAG表達(dá)細(xì)胞，使用質(zhì)譜法證實(shí)未標(biāo)記的US11與DNMT3A?GFP共分離（圖4B）。證實(shí)這種關(guān)聯(lián)不是US11或DMNT3A標(biāo)簽的產(chǎn)物。

圖3 利用IP純化US11相互作用蛋白Fig.3 Purification of US11 interacting protein by IP

3 討論

US11蛋白是一種21 kDa的高度堿性磷酸化蛋白，也是一種RNA結(jié)合蛋白，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)作用［7］。最近的報(bào)道［8］強(qiáng)調(diào)病毒感染調(diào)節(jié)宿主表觀遺傳因子，影響病毒和宿主基因的表達(dá)并創(chuàng)造有利于病毒復(fù)制的環(huán)境，因此這種關(guān)聯(lián)是有意義的。因此，本研究將重點(diǎn)放在這個(gè)關(guān)聯(lián)上。研究成功分離出HSV?1病毒的US11蛋白，并通過系統(tǒng)研究與US11相互作用的蛋白，檢測其潛在功能和調(diào)控作用。

表1 MS鑒定出與US11潛在相互作用的蛋白Tab.1 MS identified the protein potential interaction with US11

圖4 宿主DNMT3A與HSV?1 US11的相關(guān)性Fig.4 The correlation between the host DNMT3A and the HSV?1 US11

本研究設(shè)計(jì)了數(shù)個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在交替標(biāo)記的系統(tǒng)中使用交互分離，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中觀察到的US11?DNMT3A相互作用。首先，研究培養(yǎng)了一個(gè)HFF細(xì)胞系，該細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)DNMT3A，具有雙重標(biāo)記：FLAG和GFP。其次，以往對(duì)US11在HSV?1感染期間的研究主要集中在其最初轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核或感染后期的功能上（如裝配）［9］。因此本研究主要對(duì)US11從細(xì)胞核流出之前的相互作用進(jìn)行了研究，選擇感染后16 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行US11蛋白相互作用的免疫親和分離和蛋白質(zhì)組分析。在IP過程中，為了減少來自抗體的干擾，本研究選擇不可裂解的二琥珀酰亞胺辛二酸酯（DSS）交聯(lián)劑，永久性地將US11抗體綴合在蛋白質(zhì)A珠上。

對(duì)感染后16 h的US11蛋白關(guān)聯(lián)的分析顯示，病毒蛋白的相互作用具有不同的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。形成衣殼的蛋白質(zhì)被預(yù)測會(huì)以高度有序和嚴(yán)格的構(gòu)象結(jié)合。因此，即使在裂解條件下，它們與US11共同分離也就不足為奇了。已知在衣殼表面上存在pUL25衣殼蛋白，并直接與內(nèi)部被膜蛋白pUL36結(jié)合［10］。本研究的IP?MS分析結(jié)果顯示pUL17是與US11相互作用的蛋白質(zhì)，這是一種具有衣殼成熟和運(yùn)輸核功能的病毒蛋白。例如，pUL17屬于子復(fù)合物的一部分，即衣殼特異性成分，它也包含pUL25和pUL36，可能具有穩(wěn)定基因調(diào)控病毒衣殼的功能［11］。先前的研究表明，pUL17和pUL14可以影響US11的定位，但沒有證據(jù)表明這些蛋白與US11或其他HSV?1蛋白相關(guān)。由于這些蛋白在裂解條件下要么不存在，要么大量減少，因此它們與US11的關(guān)聯(lián)很可能是間接的。

本研究中試圖通過在感染期間鑒定其與宿主因子的關(guān)聯(lián)來獲得對(duì)HSV?1中RNA結(jié)合蛋白US11功能的進(jìn)一步見解。雖然鑒定了幾種潛在宿主蛋白質(zhì)，但本研究選擇關(guān)注其與DNMT3A的關(guān)聯(lián)進(jìn)一步分析，因?yàn)橐阎獊碜圆煌易宓牟《纠眉谆D(zhuǎn)移酶進(jìn)行高效復(fù)制，特別是HBV和KSHV共同選擇DNMT3A［12-13］。在發(fā)育和腫瘤發(fā)生的情況下，DNMT3A的水平與細(xì)胞增殖相關(guān)，據(jù)報(bào)道DNMT3A在正常肝細(xì)胞中表達(dá)水平低，但在肝細(xì)胞癌細(xì)胞（HCC）中水平升高，敲除DNMT3A基因減少了這些HCC細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖和集落形成［14］。目前，還沒有證明HSV?1靶向DNMT3A。通過使用免疫親和純化、質(zhì)譜和Western blot分析，本研究建立了US11和DNMT3A在人成纖維細(xì)胞中的聯(lián)系。這些結(jié)果表明US11和DNMT3A在HSV?1感染期間在細(xì)胞核中相互作用。

雖然本研究認(rèn)為所使用的DSS濃度固定對(duì)US11的抗原結(jié)合能力沒有明顯改變，但免疫共沉淀方法畢竟不能區(qū)分直接和間接的相互作用。因?yàn)榭贵w-抗原結(jié)合依賴于特定的結(jié)構(gòu)識(shí)別，抗體的活性取決于尖端結(jié)構(gòu)或抗原結(jié)合位點(diǎn)，將抗體固定到蛋白質(zhì)A珠時(shí)通過交聯(lián)可能改變尖端結(jié)構(gòu)。盡管數(shù)千種抗體具有一般結(jié)構(gòu)，但尖端結(jié)構(gòu)略有不同。DSS交聯(lián)仍可能影響抗體-抗原相互作用，掩蓋可能與抗原結(jié)合的互補(bǔ)位，影響免疫沉淀效率［15］。因此，無法徹底排除其他與US11結(jié)合的病毒或宿主蛋白可能介導(dǎo)與DNMT3A的聯(lián)系。例如較大的衣殼蛋白VP5或病毒DNA結(jié)合蛋白ICP8。盡管如此，本研究首次證明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在HSV?1感染過程中具有功能性作用。

在這項(xiàng)研究中，免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析篩查與HSV?1病毒US11蛋白存在潛在相互作用的宿主蛋白。使用這種方法，DNMT3A被定性為一種新的US11結(jié)合蛋白，揭示了US11在感染過程中潛在的新作用。這不僅為進(jìn)一步研究相關(guān)分子機(jī)制開辟了新的研究途徑，同時(shí)為治療抗病毒干預(yù)提供了可能的新靶點(diǎn)。