平 浩 馬林祥 王明帥 龍 軍 牛亦農(nóng) 劉躍新 邢念增

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院泌尿外科，北京 100730; 2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院泌尿外科，北京 100020; 3.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系，北京 100069; 4.國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院，北京 100021)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是歐美國家發(fā)病率第一位的男性惡性腫瘤，病死率僅次于肺癌。我國近年來前列腺癌發(fā)病率和病死率呈逐漸升高趨勢，尤其是如果不能早期發(fā)現(xiàn)易發(fā)生遠處轉移，包括骨轉移和肺轉移等，嚴重威脅著老年患者生命健康[1]。目前研究[2]顯示，單羧酸轉運蛋白4(monocarboxylate transporters 4, MCT4)作為單羧酸轉運蛋白家族的重要成員，不僅可以參與腫瘤的新陳代謝，還可能誘導和促進腫瘤的惡性生物學行為，可作為腫瘤新的生物學指標和治療靶點[3]。MCT4可將腫瘤細胞產(chǎn)生的大量乳酸轉運到細胞外，并維持內(nèi)環(huán)境及pH值的穩(wěn)定，促進腫瘤細胞遷移和侵襲，并為腫瘤細胞的有氧代謝提供原料[4]。近年來研究[5]證實，MCT4在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且與腫瘤的增生、侵襲及預后密切相關。但MCT4在中國人群前列腺癌中的表達和調控機制，目前尚不完全清楚。

本研究著重觀察MCT4蛋白在前列腺癌組織和細胞中的表達情況，探討其與前列腺癌惡性程度和轉移的關系，同時研究MCT4在前列腺癌細胞中的調控機制，明確其在前列腺癌發(fā)展和轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2012至2018年首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院部分手術標本及病理科存檔標本，其中PCa 56例，前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)30例，癌旁組織(para-carcinoma tissues，PCT)20例，患者平均年齡為(62.4±7.9)歲。標本來自前列腺根治性切除術、前列腺摘除術及前列腺電切術患者，均經(jīng)病理科醫(yī)師病理診斷證實。依照Gleason評分標準， Gleason≤7者38例， Gleason>7者18例。前列腺癌淋巴結轉移陽性患者12例，無轉移患者44例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號：2013-X-83)。免疫組織化學及免疫印跡(Western blotting)所用抗體為MCT4、E-Cadherin、N-Cadherin及p-ERK1/2單克隆抗體，購自美國BD、Santa Cruz及Cell Signaling公司。慢病毒載體系統(tǒng)LVpFU-GW-RNAi購自上海吉凱基因有限公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組織化學檢測MCT4在前列腺癌組織中的表達

采用免疫組織化學SP法，按照試劑盒說明書逐步操作，在組織切片中加入一抗(兔抗人MCT4單克隆抗體)和二抗后，聯(lián)苯二胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)代替一抗。結果判定：MCT4蛋白表達表現(xiàn)為陽性著色主要位于細胞質，顏色呈淡黃色、棕黃色或棕褐色著色。陽性表達根據(jù)著色程度和陽性細胞百分比綜合作半定量分析。①按顯色強度評分：細胞無顯色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。②按陽性細胞百分率評分：200倍視野下計數(shù)，無陽性細胞為0分；陽性細胞率<10%為1分；10%～50%為2分；51%～80%為3分；>80%為4分。上述兩項評分相乘為0分視為表達陰性，1～5分為低表達，6～12分為高表達[6]。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉染

正常前列腺上皮細胞系RWPE-1(中科院上海細胞庫)培養(yǎng)于培養(yǎng)基K-SFM中，人前列腺癌細胞系LNCap、PC3、DU145分別培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640及DMEM培養(yǎng)基中，所有細胞均在飽和濕度、37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2條件下培養(yǎng)。將PC-3細胞接種于24孔培養(yǎng)板，接種濃度5×104/孔，細胞融合達到40%時，干擾組(shRNA-MCT4)加pFU-GFP-MCT4-RNAi慢病毒顆粒。設陰性對照組(shRNA-NC)，加對照病毒。6 h后觀察無細胞毒性，24 h后更換培養(yǎng)液，以后常規(guī)換液傳代。72 h后熒光倒置顯微鏡觀察轉染效率，轉染效率>80%的細胞培養(yǎng)一周后用于提取蛋白。

1.2.3 蛋白提取及Western blotting檢測

收集細胞后，提取總蛋白，分別取50 μg上樣， 12%(質量分數(shù))SDS-PAGE分離蛋白，120 V恒壓電泳1 h。分離后的蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%(質量分數(shù))脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，分別加入一抗(稀釋比例均為1∶500)，4 ℃孵育過夜。次日用TBST緩沖液沖洗漂洗后，再加入HRP標記的相應IgG二抗(稀釋比例為1∶2 000)，在室溫條件下反應1 h，TBST洗膜。其中以Actin作為內(nèi)對照。最后采用ECL發(fā)光法顯色，X線進行膠片曝光，采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分數(shù)表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌、前列腺增生及癌旁組織中MCT4蛋白的表達

免疫組織化學染色顯示，MCT4蛋白表達主要位于間質細胞和腫瘤細胞的胞膜和胞質中。56例前列腺癌組織中，MCT4蛋白表達陽性者有48例，陽性表達率為85.7%；而癌旁組織中12例呈陽性，陽性表達率為60%(12/20)；良性前列腺增生組織中16例呈陽性，陽性表達率為53.3%(16/30)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。詳見表1及圖1。

表1 MCT4蛋白在前列腺癌、前列腺增生及癌旁組織中的表達Tab.1 Expression of MCT4 in PCa, PCT and BPH

MCT4:monocarboxylate transporters 4;PCa:prostate cancer;PCT:para-carcinoma tissues;BPH:benign prostatic hyperplasia.

圖1 免疫組織化學法檢測MCT4蛋白在組織中的表達情況Fig.1 Expression of MCT4 protein was detected with immunohistochemistry

A:BPH(400×);B:PCT(400×);C:PCa (200×);D:PCa(400×);MCT4:monocarboxylate transporters 4;BPH:benign prostatic hyperplasia;PCT:para-carcinoma tissues;PCa:prostate cancer.

2.2 MCT4蛋白在前列腺癌細胞中的表達

Western blotting檢測結果顯示，在前列腺正常上皮細胞RWPE-1及激素依賴性前列腺癌細胞LNCap中MCT4表達較弱，而在惡性程度較高的去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)細胞PC3及DU145中表達明顯增強，說明MCT4可能與細胞的惡性程度明顯相關(圖2)。

2.3 MCT4蛋白表達與前列腺癌臨床特征之間的關系

MCT4蛋白表達與前列腺癌是否有淋巴結轉移密切相關，12例淋巴結轉移患者均有陽性表達，轉移組顯著高于非轉移組，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.022)。而通過分析MCT4蛋白表達與前列腺癌臨床病理因素的關系顯示，MCT4表達水平在不同前列腺癌的病理分級之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.122)，詳見表2。

圖2 Western blotting檢測MCT4在前列腺癌細胞中的表達情況Fig.2 Expression of MCT4 in prostate cancer cells was examined with Western blotting

MCT4:monocarboxylate transporters 4.

2.4 MCT4在前列腺癌中的調控

熒光顯微鏡下觀察病毒轉染情況，轉染效率>80%(圖3)。Western blotting檢測抑制MCT4表達后，對N-cadherin、E-cadherin及pERK1/2的影響。結果顯示，與陰性對照組(shRNA-NC)相比，RNA干擾組(shRNA-MCT4)不僅明顯降低了MCT4蛋白水平，而且使N-cadherin及pERK1/2的蛋白表達下降，同時使E-cadherin蛋白表達水平升高，說明MCT4不但在前列腺癌的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中可能發(fā)揮重要作用，還可能參與ERK信號通路，從而調節(jié)細胞代謝和功能(圖4)。

表2 PCa中MCT4蛋白表達與臨床病理因素的關系Tab.2 Relationship between MCT4 expression and the clinicopathological features of PCa

圖3 熒光顯微鏡檢測病毒轉染效率Fig.3 Transfection efficiency observed with fluorescence microscopy(100×)A: light microscopy;B: fluorescence microscopy.

3 討論

目前，早期發(fā)現(xiàn)并手術切除仍然是治愈前列腺癌較為有效的方法，但很多患者就診時往往已屬于中晚期，手術效果不理想或失去了手術根治的機會，目前雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy, ADT)是晚期前列腺癌的最重要治療手段[7]。然而，不幸的是，多數(shù)前列腺癌患者經(jīng)過18～24 個月的內(nèi)分泌治療后，會變得對ADT 不敏感，從而轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔?androgen-independent prostate cancer, AIPC)或CRPC，最終進展或發(fā)生遠處轉移，是前列腺癌患者腫瘤特異性死亡的重要原因[8]。因此，亟待找到新的或更好的腫瘤標志物或靶點，才可能解決晚期前列腺癌的治療問題。近年來發(fā)現(xiàn)，多數(shù)腫瘤細胞生長于相對缺氧的環(huán)境中，糖酵解是腫瘤細胞獲取能量的主要方式，是構建新血管的最重要的能量來源[9]。而糖酵解產(chǎn)生大量乳酸、丙酮酸等酸性產(chǎn)物，造成細胞內(nèi)酸化，并反饋性抑制糖酵解反應，從而抑制腫瘤細胞的生長和增生。單羧酸轉運蛋白家族則主要通過介導乳酸的跨膜轉運實現(xiàn)對糖酵解的調控，該蛋白家族共有14個亞型，在多數(shù)正常細胞和組織中的乳酸轉出主要是MCT1負責，但在一些細胞中，如腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞，其乳酸的轉出主要由MCT4介導，因此，MCT4在腫瘤發(fā)展中起到重要的調控作用[10]。研究[11-12]表明，MCT4在多種腫瘤組織中高表達，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、腎癌及宮頸癌等腫瘤，參與腫瘤增生、侵襲及轉移，且與腫瘤患者的生存期呈負相關，預后不良。

圖4 MCT4抑制后對N-cadherin、E-cadherin及 pERK1/2蛋白的調控作用Fig.4 Expression of N-cadherin, E-cadherin and pERK1/2 after inhibition of MCT4 in PC3 cells

MCT4:monocarboxylate transporters 4；NC:normal control.

本研究免疫組化結果顯示，在前列腺增生組織和癌旁組織中，MCT4蛋白均有一定程度表達，但表達水平明顯低于前列腺癌組織，差異有統(tǒng)計學意義。MCT4在前列腺癌的陽性表達率可達85.7%，主要表達于間質細胞和腫瘤細胞中，可能與腫瘤細胞間或腫瘤細胞與間質細胞間的乳酸運輸有關。另外，MCT4蛋白表達還與前列腺癌是否有淋巴結轉移關系密切，淋巴結轉移患者陽性表達率明顯高于非轉移患者，因此，MCT4可能是促進前列腺癌轉移的重要因素。在前列腺癌組織中，筆者研究了MCT4蛋白表達與前列腺癌臨床病理因素的關系發(fā)現(xiàn)，MCT4表達水平在不同前列腺癌的病理分級之間差異無統(tǒng)計學意義。但有報道[13]顯示它在CRPC中表達更高，可能參與CRPC形成的進程。Western blotting檢測不同細胞系中MCT4表達顯示，CRPC的PC-3及DU145細胞中蛋白較高，而雄激素依賴性前列腺癌Lncap及前列腺正常上皮細胞中MCT4表達較弱。在PC-3中應用RNAi抑制MCT4表達后，能明顯降低N-cadherin及ERK1/2的表達，而使E-cadherin表達升高，說明MCT4可能參與EMT進程及ERK1/2通路，因此，MCT4作為糖酵解途徑中的關鍵蛋白可能成為潛在的治療前列腺癌的新靶點[14]。Gao等[15]應用siRNA下調肝癌中MCT4表達，發(fā)現(xiàn)可明顯降低癌細胞增生、遷移及侵襲。另外，MCT4與尿路上皮侵襲性和預后密切相關，穩(wěn)定敲除MCT4后可以明顯抑制腫瘤細胞生長，減小腫瘤體積[16]。Gerlinger等[17]研究表明，MCT4可降低乳酸分泌，降低細胞內(nèi)pH和ATP水平，并導致腎透明細胞癌細胞G2/M停滯，誘導細胞凋亡?？傊词乖谟醒鯛顟B(tài)下，腫瘤細胞也會優(yōu)先進行糖酵解，腫瘤通過瓦伯格效應獲取能量，因此腫瘤代謝逐漸成為研究熱點[18]。MCT4不僅在糖酵解過程中扮演重要角色，在前列腺癌中還可以調控EMT及ERK信號通路，促進細胞增生、侵襲及轉移，并可能最終導致CRPC的發(fā)生[19]。

近年來腫瘤代謝研究領域快速發(fā)展，以腫瘤治療為標志的代謝性研究已經(jīng)成為生物醫(yī)學研究的熱點領域。本研究中樣本量相對較小，需進一步擴大樣本量，并深入研究MCT4在前列腺癌中的表達和調控機制，以有助于為以MCT4為靶點的治療提供依據(jù)，并為去勢抵抗前列腺癌提供新的治療方案。