林彥星 曹琛福 楊俊興 阮周曦 吳江 呂建強 花群義

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASF virus，ASFV）感染引起的豬的一種急性、烈性、高度傳染性疾病，以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將 ASF列為法定報告疫病，我國將其列為一類動物疫病。ASFV是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）的唯一成員，是一種具有二十面體形態(tài)的有包膜的雙鏈DNA病毒，平均直徑為200 nm。不同分離株的基因組長度在170～190 kb之間變化，具有共價的閉合末端、反轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ASF最早發(fā)生于肯尼亞，隨后逐漸在非洲、美洲和歐洲的多個國家流行，近10年來，全球已有41個國家報告發(fā)生ASF疫情。俄羅斯自ASF傳入以來，養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失，我國與俄羅斯接壤邊界線長達4370 km，邊境地區(qū)情況復(fù)雜，有野豬和生物媒介軟蜱分布，疫情極易跨境傳播。從2014年1月至2017年 7月，俄羅斯伏爾加格勒州等 31個地區(qū)發(fā)生 166起野豬和 304起家豬 ASF疫情，898頭野豬和 10393頭家豬感染2017年3份，俄羅斯伊爾庫茲克州發(fā)生ASF疫情，疫點距我國滿洲里口岸不足1000 km，ASF跨境傳入我國的風(fēng)險逐步增加。由于目前沒有有效的治療方法或疫苗來預(yù)防 ASF，一旦發(fā)生疫情很難根除和凈化，只能通過執(zhí)行嚴格的衛(wèi)生防疫措施，撲殺染疫動物控制疫情蔓延；對于非ASF疫區(qū)國家來說，建立快速有效的檢測方法對防止該病傳入具有重要意義?，F(xiàn)就ASFV實驗室診斷方法進行綜述，以期為我國 ASF診斷方法研究提供技術(shù)參考。

1 病原鑒定

1.1 血球吸附 （haemadsorption，HAD）試驗

HAD試驗是基于豬的紅細胞能夠吸附在感染 ASFV單核細胞或巨噬細胞表面，在出現(xiàn)細胞病變（cytopathic effect，CPE）之前形成特征性的玫瑰花環(huán)狀，絕大多數(shù)從非洲分離的 ASFV毒株以及最初從歐洲國家分離的 ASFV毒株均產(chǎn)生豬紅細胞吸附現(xiàn)象。1963年，TUBIASH等在西班牙首次發(fā)現(xiàn)了不能吸附紅細胞的ASFV，這些毒株能在白細胞培養(yǎng)物內(nèi)產(chǎn)生細胞病變，但沒有紅細胞吸附能力；因此對HAD試驗陰性結(jié)果應(yīng)通過PCR和/或FAT來確認以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。由于HAD試驗過程至少需要7～10 d，且對實驗室要求較高，通常只有參考實驗室采用該方法。

1.2 熒光抗體試驗（fluorescent antibodytest，F(xiàn)AT）

FAT可以用作ASFV抗原檢測的一種輔助方法，該法利用標記了異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocanate，F(xiàn)ITC）的抗 ASFV特異性抗體能夠與豬感染組織（尤其是脾臟、肺、腎和淋巴結(jié)）涂片中的ASFV抗原相結(jié)合，通過抗體發(fā)出的熒光判斷樣品中是否有抗原存在。FAT可用于田間疑似感染豬或?qū)嶒炇医臃N豬組織的 ASFV抗原檢測，也可以用于鑒定無紅細胞吸附能力的毒株，還可用于區(qū)分ASFV和其他病毒（如偽狂犬病病毒）或細胞毒性接種物產(chǎn)生的CPE。但對于亞急性或慢性型ASF，F(xiàn)AT敏感性明顯下降，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這可能與感染組織中形成的抗原抗體復(fù)合物阻斷ASFV抗原和ASF標記物之間的相互作用有關(guān)。

1.3 雙抗體夾心 ELISA/抗原捕獲ELISA

VIDAL等以抗ASFVVP73蛋白的特異性單克隆抗體為基礎(chǔ)建立了夾心ELISA方法，該方法利用包被于酶標板上的單克隆抗體捕捉ASF病毒粒子，再通過酶標抗體與病毒進一步結(jié)合，最后顯色判定樣品中是否存在 ASFV抗原，最低可以檢測 VP73抗原質(zhì)量濃度為0.05 mg/L，2.3×102PFU/mL全病毒顆粒。HUTCHINGS等建立了 2種間接的夾心ELISA法檢測ASFV抗原，一種使用的是針對細胞質(zhì)中可溶性病毒蛋白產(chǎn)生的多克隆抗血清，第二種是抗VP73蛋白和多克隆血清的單克隆抗體的組合，結(jié)果表明利用多克隆抗血清比使用單克隆抗體稍微敏感些。AFAYOA等將純化的病毒 VP73蛋白免疫家兔制備多克隆抗體用于夾心 ELISA的抗原捕獲，ELISA的診斷靈敏度為82.95%（95%CI，78%～100%），診斷特異性為96.59%（95%CI，90%～100%）。

1.4 測流分析（lateral flow assay，LFA）

SASTRE等利用抗VP72蛋白的單克隆抗體作為檢測線捕獲試劑，抗血清蛋白 IgG單克隆抗體作對照線捕獲試劑制備了用于檢測血液中ASFV的試紙條，并與商品化抗原ELISA和PCR進行比較。對于試驗感染樣品，LFA跟ELISA有很好的相關(guān)性，LFA對動物循環(huán)病毒水平超過104HAU是有效的，PCR則更為敏感；對于田間樣品，PCR同樣可以檢出更多陽性樣品，LFA檢出的陽性樣品數(shù)則超過ELISA。

1.5 病毒基因組檢測

1.5.1 酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reacion，PCR）目前，使用最廣泛的ASFV檢測技術(shù)是PCR，即根據(jù) ASFV基因組高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物進行PCR擴增檢測ASFV核酸。OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊提供了幾種PCR方案。這些方案包括用于區(qū)分ASF和CSF的多重PCR和實時PCR。PCR技術(shù)的廣泛傳播及其適用性廣使其成為世界各地實驗室的常規(guī)方法，近年來研究人員建立了多種PCR法檢測ASFV。

TIGNON等根據(jù)P72基因保守區(qū)域設(shè)計引物探針，建立了同時檢測內(nèi)參基因豬β-肌動蛋白和ASFV的多重實時熒光PCR，該方法已被4個歐盟ASF國家參考實驗室驗證。RONISH等建立一種基于線性指數(shù)PCR （linear-after-the-exponential PCR，LATE-PCR）檢測ASFVVP72基因的方法，LATE-PCR是不對稱PCR，該法直接擴增大量的單鏈DNA，在終點讀取熒光值，通過溶解曲線分析驗證靶基因的擴增，檢測限達到幾個拷貝，為實驗室和田間ASF診斷提供一種新方法。HAINES等建立了檢測ASFV、CSFV和外源內(nèi)控RNA的三重實時熒光PCR，提取核酸前將外源內(nèi)控RNA添加到樣品中，作為核酸提取和 PCR擴增控制，可識別假陰性結(jié)果，該法的檢測最低限為22個ASFV基因組拷貝和5個CSFV基因組拷貝；對ASFV、CSFV的診斷靈敏度均為100%，特異性分別為 97.3%和100.0%。 FERNANDEZ-PINERO 等使用商品化通用探針庫（universal probe library，UPL）探針與設(shè)計的特異性引物對組合來擴增VP72基因中的DNA片段，該法檢測限小于18DNA拷貝，且比OIE手冊推薦的TaqMan實時熒光PCR更為靈敏。

WOZNIAKOWSKI等利用一種新型的聚合酶交叉螺旋反應(yīng)（polymerase cross-linkings piral reaction，PCLSR）技術(shù)檢測豬血中ASFVDNA，PCLSR使用 3條引物進行擴增，2條外螺旋引物包括ASFVP72基因 3′ 端互補序列和黑寡婦α-內(nèi)毒素外源基因5′ 端反向互補序列，另外一條交聯(lián)引物為ASFVP72基因特異性引物，該方法對含有P72基因的質(zhì)粒靈敏度達到7.2×102拷貝/μL。LUO 等基于 GenBank中所有可用的ASFVVP73基因序列高度保守區(qū)域設(shè)計了特異性引物，建立了改進的PCR方法，該法比2種經(jīng) OIE確認的 PCR法更敏感，對62份豬血檢測結(jié)果與 UPL實時熒光PCR法一致。FRACZYK等首次建立了交叉引物擴增方法（crosspriming amplification method，CPA）檢測豬血液和血清中ASFVDNA，該法與UPL實時熒光PCR法具有相同的靈敏度，對含有P72基因的標準質(zhì)粒靈敏度達7.2拷貝。

我國研究人員也先后建立了ASFV普通PCR法和實時熒光PCR法，均具有良好的敏感性和特異性，可用于ASFV核酸檢測。崔尚金等將納米金顆粒作為熱導(dǎo)介質(zhì)建立了ASFV高效納米PCR檢測方法，敏感性是常規(guī)PCR的1000倍，最低可檢出10個拷貝核酸。

1.5.2 重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）RPA是一項由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶等參與，在等溫條件下進行核酸擴增的新技術(shù)。實時熒光RPA法結(jié)合一個便攜式的等溫擴增儀可在15 min內(nèi)獲得檢測結(jié)果，檢測時間和便利性優(yōu)于傳統(tǒng)PCR法。王建昌等建立了一種ASFV RPA等溫檢測方法，38℃水浴恒溫反應(yīng) 30 min實現(xiàn)對目的片段的有效擴增，對含ASFVVP72基因質(zhì)粒的擴增，方法檢測限與OIE推薦的實時熒光PCR法一致。

1.5.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop amplification assays，LAMPs）LAMPs與傳統(tǒng)PCR相比，操作簡單、快速靈敏，無需特殊儀器。JAMES等針對 ASFV 拓撲異構(gòu)酶 Ⅱ 基因建立了一步法檢測ASFV的LAMPs方法，最低可以檢測到 330拷貝DNA的病毒。ATUHAIRE等比較了LAMPs法跟OIE推薦的PCR法的靈敏度和特異性，結(jié)果顯示 LAMPs法對田間樣品中ASFV DNA檢測靈敏度高于PCR法。國內(nèi)學(xué)者均根據(jù)ASFVP72基因建立了ASF LAMPs檢測方法，特異性良好，與常規(guī)PCR比靈敏度高，可用于ASF快速檢測。

1.5.4 原位雜交 （in situ hybridization，ISH）ISH是將標記的核酸探針與組織細胞中的待檢測核酸特異結(jié)合，再用檢測系統(tǒng)檢測標記探針，同時顯示核酸所在的位置。BALLESTER等使用 ISH技術(shù)，用地高辛標記的探針檢測福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的ASFVDNA，并取得較好的檢測效果。

2 抗體檢測

由于目前仍無有效的疫苗能夠用于預(yù)防 ASF，不存在疫苗抗體干擾的問題，而感染 ASFV強毒的豬在產(chǎn)生抗體前已經(jīng)死亡，因此檢測到 ASFV抗體則表明可能存在低毒力或中等毒力ASFV感染。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是ASF血清學(xué)研究中最常用的方法，可檢測血清和組織液，適用于大量樣品的篩查，是國際貿(mào)易指定的檢測方法。近年來研究人員利用原核/真核表達的蛋白作為檢測抗原建立了多種ELISA方法。GALLARDO等利用原核表達的4種重組融合蛋白作為抗原，其中基于重組蛋白p54、pB602L和pK205R的 ELISA方法敏感性和特異性與OIE推薦的方法相當，可用于保存不當?shù)难錋SFV抗體的檢測。曹琛福等用原核表達純化的 P54蛋白建立的間接 ELISA法可檢測到 1∶1280稀釋樣品，而靳雯雯等用原核表達的 VP73蛋白建立的間接 ELISA方法檢測靈敏度可以達到1∶2560，與進口試劑盒相當。GIMENEZLIROLA等利用原核表達的重組蛋白p30建立的雙矩陣間接ELISA方法，可用于檢測血清和口腔液樣本中ASFV抗體。

SAKAMOTO等在昆蟲細胞中表達蛋白P32和P54作為檢測抗原，試驗結(jié)果顯示，在免疫印跡中，P54在感染早期的抗體檢測中敏感性比P32更高，而P32在間接ELISA中表現(xiàn)出更好的反應(yīng)性。董志珍等利用單克隆抗體建立的競爭ELISA方法靈敏度高于間接免疫熒光法，可用于豬血清的 ASFV抗體檢測。曾少靈等和梁云浩等分別用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達VP73、P54蛋白作為間接ELISA檢測抗原，均具有很好的特異性。NIETO-PELEQRIN等分別用半純化的ASFV VP72蛋白和人胚胎腎細胞（HEK 293T）表達的重組ASFV VP30蛋白作為間接ELISA檢測抗原，首次在接種豬糞便樣本中檢測到AFSV抗體，這2種ELISA方法對現(xiàn)場條件下ASF監(jiān)測可能非常有用。

2.2 間接熒光抗體試驗（indirect fluorescent antibodytest，IFA）

IFA可用于檢測感染 ASFV豬的血清樣品。將感染ASFV豬的腎細胞或猴細胞固定到載玻片上，使被檢血清與載玻片上的抗原結(jié)合，將已結(jié)合的抗體與熒光素標記的豬免疫球蛋白抗體結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。IFA適用于無ASF流行地區(qū)ELISA檢測陽性的血清以及來自地方性流行的地區(qū)經(jīng) ELISA檢測無法確定結(jié)果的血清確證試驗。

2.3 免疫印跡檢測（immunoblotting test）

免疫印跡是將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)與血清學(xué)相結(jié)合的一種免疫生化技術(shù)，ASFV感染細胞漿中可溶性病毒蛋白經(jīng)丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再與待檢血清樣品反應(yīng)，加入酶標二抗，洗膜后加入底物顯色，通過與陽性對照比對（條帶形狀、顏色強度等）判定試驗結(jié)果。該方法特異性高，能簡單客觀的判定結(jié)果，能識別出弱陽性結(jié)果，可作為IFA替代方案對個別不確定結(jié)果進行確證。

2.4 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一項檢測技術(shù)，操作簡便、特異靈敏，可直接觀察結(jié)果，適合基層現(xiàn)場檢測。張鑫宇等原核表達 P54重組蛋白，用膠體金標記后噴涂纖維墊，并分別以SPA和抗P54多克隆抗體作為檢測線和質(zhì)控線，制作ASF VP54抗體檢測膠體金免疫層析試紙，具有特異性強、敏感性高等特點。

3 展望

近年來，隨著世界經(jīng)濟全球化的發(fā)展以及自然生態(tài)環(huán)境的改變，一些嚴重危害人類和動物健康的疫病（如亞洲Ⅰ型口蹄疫、小反芻獸疫）已傳入我國，嚴重影響我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。當前ASF傳入我國的風(fēng)險不容忽視，一旦傳入將會給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。因此，對該病實驗室診斷技術(shù)的研究儲備對防止該病傳入和傳播至關(guān)重要。

研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種 ASF實驗室診斷方法，以便在現(xiàn)場條件下進行早期診斷。對于病原檢測，普通PCR、熒光PCR等病毒基因組檢測方法在ASFV早期診斷中發(fā)揮重要作用；并已開發(fā)出簡單快速的技術(shù)，包括RPA、LAMPs等，這些快速檢測方法有助于官方盡早采取控制措施，從而減少疫病傳播的負面影響。血清學(xué)檢測方面，由于不存在疫苗抗體干擾的問題，通常檢測到ASFV抗體則表明可能存在低毒力或中等毒力ASFV感染，因此，血清學(xué)檢測對非ASF疫區(qū)國家的進口檢疫監(jiān)測具有重要的意義，建立快速、敏感、特異的ASFV抗體快速檢測方法已成為越來越多研究者研究的重點。

（摘自《中國獸醫(yī)學(xué)報》2018年第10期）