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        高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定糧油中黃曲霉毒素B1

        2019-01-28 02:15:34宋寒寒山東中質(zhì)華檢測(cè)試檢驗(yàn)有限公司
        食品安全導(dǎo)刊 2018年30期
        關(guān)鍵詞:親和柱甲酸內(nèi)標(biāo)

        □ 宋寒寒 黃 浩 山東中質(zhì)華檢測(cè)試檢驗(yàn)有限公司

        1 前言

        黃曲霉毒素B1(AFB1)對(duì)人畜的健康危害極大,所以對(duì)它的監(jiān)控十分必要。目前食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品中AFB1的測(cè)定方法依照GB 5009.22-2016,分別有同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、柱前衍生法、柱后衍生法、薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附篩查法。目前主要應(yīng)用的是液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。本課題以糧油為基質(zhì)研究AFB1的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,探究不同的條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,旨在簡(jiǎn)化前處理步驟、降低成本、提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

        2 實(shí)驗(yàn)部分

        2.1 儀器、材料與試劑

        Agilent Technologies液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜儀、湘儀高速冷凍離心機(jī)、北京普析純水機(jī)、上海精科實(shí)業(yè)有限公司渦旋振蕩器、Eppendorf單道微量移液器、美國(guó)Organomation氮吹儀、Waters固相萃取裝置。

        北京康源泰博生物科技有限公司黃曲霉毒素B1免疫親和柱、BONNAAGELA TECHNOLOGIES Cleanert MC。

        甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純;水為一級(jí)水;ANPEL AFB1外標(biāo)(濃度為1 mg/L,-10 ℃貯存);Biopure AFB1同位素內(nèi)標(biāo)(濃度為0.5 μg/mL,-18 ~ -22 ℃貯存)

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        用乙腈將AFB1標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為20 μg/kg的使用液,轉(zhuǎn)移至棕色標(biāo)品試劑瓶中。用乙腈將AFB1內(nèi)標(biāo)配制成濃度為50 μg/kg的使用液,轉(zhuǎn)移至棕色標(biāo)品試劑瓶中。以上標(biāo)品使用液的貯存條件為-18 ℃避光。將0.1%甲酸水溶液與乙腈以1∶9的比例混合,配置成稀釋液,待用。AFB1使用液中加入稀釋液,配制成0.5、1、2、5、10、20 μg/kg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液都含有0.5 μg/kg的AFB1內(nèi)標(biāo)。

        2.3 儀器條件與方法設(shè)置

        2.3.1 色譜條件

        流動(dòng)相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度 A 相 為 90%(1~2 min),10%(2~5 min),90%(6~7 min);流速0.4 mL/min;色譜柱為Agilent C18(2.1×50 mm、1.8μm、1200 bar);柱溫40 ℃。

        2.3.2 質(zhì)譜條件

        母離子的選擇:根據(jù)AFB1分子的化學(xué)電離性質(zhì),結(jié)合儀器條件與流動(dòng)相的選擇,離子化模式選為AJS ESI+。簡(jiǎn)化掉色譜柱的保留作用,通過(guò)直接進(jìn)樣法,進(jìn)行母離子掃描。在一級(jí)全掃描狀態(tài)下得到準(zhǔn)分子離子,調(diào)節(jié)儀器碎裂電壓(Fragmentor)使母離子豐度達(dá)到最大,確定AFB1的母離子質(zhì)量數(shù)。

        子離子的選擇與優(yōu)化:進(jìn)一步進(jìn)行子離子掃描,采集碎片離子信息,選擇豐度較大、靈敏度較好且干擾較小的兩對(duì)碎片離子作為定性子離子和定量子離子,并對(duì)子離子進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置一個(gè)合適的碰撞能量區(qū)間(可多次調(diào)整),其中能產(chǎn)生最高豐度子離子的數(shù)值即為最優(yōu)電壓,以達(dá)到最佳靈敏度。

        2.4 樣品前處理

        2.4.1 提取

        稱取5 g樣品于50 mL離心管中,加入相應(yīng)標(biāo)品使用液渦旋振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 mL甲酸-水-乙腈溶液(比例為0.1∶15.9∶84),渦旋混勻,在9 000 r/min下離心5 min,取上清液備用。

        2.4.2 凈化

        準(zhǔn)確移取4 mL上清液,加入46 mL 1%吐溫-20的PBS,混勻。將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫,待原有液體流盡,將樣液移至免疫親和柱上方的注射器筒中,調(diào)節(jié)至以1 mL/min的速度穩(wěn)定下滴。樣液過(guò)濾完后,再加入2×10 mL水淋洗、抽干。在親和柱下方放置10 mL刻度試管,加入2×2 mL甲醇洗脫,控制1 mL/min的速度下滴。收集全部洗脫液,50 ℃下氮?dú)獯蹈桑?.0 mL初始流動(dòng)相定容,0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,待進(jìn)樣。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 色譜條件的優(yōu)化

        溶液經(jīng)由電噴霧霧化,形成微小霧滴,進(jìn)而電離。因此溶液的成分對(duì)AFB1的離子化效率有所影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同成分的流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示當(dāng)乙腈中加入適量的甲酸,創(chuàng)造出酸性環(huán)境,離子化效率較高,并且峰形較好、AFB1響應(yīng)較高(見(jiàn)圖1至圖5)。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液與乙腈作為流動(dòng)相。

        圖1 AFB1色譜圖

        圖2 AFB1色譜圖(含有甲酸)

        圖3 AFB1豐度比

        圖4 AFB1豐度比(含有甲酸)

        3.2 提取液的優(yōu)化

        AFB1是極性較強(qiáng)的化合物,對(duì)于固態(tài)樣品,可在研磨后直接使用提取液提取;對(duì)于液態(tài)樣品,多為油脂類(lèi)化合物,可采用萃取的方法提取。本實(shí)驗(yàn)使用不同的提取液多次重復(fù)試驗(yàn),對(duì)樣品的加標(biāo)回收率對(duì)比,結(jié)果表明以甲酸-水-乙腈溶液(0.1∶15.9∶84)作為提取液時(shí),回收率最高(見(jiàn)表1)。

        表1 不同提取液對(duì)應(yīng)的AFB1回收率

        圖5 AFB1質(zhì)譜圖

        3.3 提取次數(shù)的優(yōu)化

        基質(zhì)與提取液中的AFB1濃度總是存在一定的平衡關(guān)系,隨著提取次數(shù)的增加,基質(zhì)中的AFB1會(huì)被更充分的提取出來(lái)。通過(guò)提取1次、2次、3次、4次、5次的回收率對(duì)比,2次提取能明顯的提高回收率,但是再繼續(xù)提取,并沒(méi)有相對(duì)等量的效果提升。結(jié)合時(shí)間、資源成本等考慮,以2次提取為最佳。

        3.4 凈化方式的優(yōu)化

        本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了免疫親和柱和Cleanert MC兩種凈化方法。免疫親和柱是利用抗原抗體反應(yīng)原理來(lái)進(jìn)行化合物的篩選,針對(duì)性強(qiáng),不能同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素。Cleanert MC通用性強(qiáng),使用方法簡(jiǎn)單,對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備非常少。并且無(wú)需活化、洗脫、氮吹等步驟,一步過(guò)濾實(shí)現(xiàn)凈化。兩種方法均能達(dá)到85%~100%的回收率,結(jié)合操作方法、成本考慮,使用Cleanert MC更佳。

        3.5 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)化

        本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用了內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法進(jìn)行分析。在提取基質(zhì)AFB1的過(guò)程中,經(jīng)過(guò)容器、耗材的吸附以及部分溶液殘留,AFB1的微量損失是不可避免的,內(nèi)標(biāo)法就是利用內(nèi)、外標(biāo)化合物的等比例損失,來(lái)消除這種誤差。相比而言,外標(biāo)法就與前處理及凈化過(guò)程有關(guān),操作步驟越簡(jiǎn)單、凈化效率越高,則外標(biāo)法回收率越高。通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)對(duì)比,內(nèi)標(biāo)法的結(jié)果更加準(zhǔn)確,外標(biāo)法成本低、對(duì)環(huán)境的污染比較小。

        4 結(jié)論

        本文建立了糧油中的AFB1的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法前處理步驟簡(jiǎn)單、條件易于控制、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、成本低廉,能夠滿足各個(gè)地區(qū)對(duì)AFB1檢測(cè)的要求,適用于日常糧油中AFB1的檢測(cè)。

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