李卓瓦，袁曉蕓，趙鑫磊，王曉真，張 倩，尹志成

(1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東棗莊277160;2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012)

石榴(Punica granatum L.)為石榴科石榴屬木本植物，原產(chǎn)于地中海至亞洲西部，現(xiàn)在我國(guó)南北各省均有栽培，是一種常見(jiàn)的果樹(shù)［1］。商業(yè)化的石榴盆景是魯南地區(qū)石榴資源開(kāi)發(fā)的特色產(chǎn)業(yè)和支撐產(chǎn)業(yè)，自然淘汰的老根外皮只有極少部分作為中藥材“石榴根皮”被利用，絕大多數(shù)石榴根皮資源被浪費(fèi)。石榴根皮具有收斂止瀉、殺蟲(chóng)之功效，用于治療腸炎、痢疾、絳蟲(chóng)等疾?。?］。近年來(lái)，大量研究證明植物多酚類(lèi)成分廣泛存在于石榴植物體的多個(gè)部位，而且普遍具有較好的生物活性。例如，鄧娜等［3］研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮、石榴籽和石榴瓤中都含有多酚類(lèi)成分，且均具有較好的抗氧化活性。劉振平等［4］研究證實(shí)，石榴葉和石榴汁中沒(méi)食子酸、石榴皮鞣素及鞣花酸等多酚類(lèi)成分含量較高，具有良好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。國(guó)外已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道石榴根皮中存在多酚類(lèi)成分［5］，但是，對(duì)其提取工藝及其抗氧化領(lǐng)域的研究，還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

超聲波輔助提取原料組成成分，是一種物理破碎過(guò)程，主要利用超聲波空化效應(yīng)增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速率，增加溶劑穿透力，促進(jìn)功效成分的溶出。有研究證實(shí)［6－7］，超聲波輔助提取植物材料中多酚類(lèi)成分，具有條件溫和、環(huán)境友好、可操作性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，有效避免了活性成分被氧化而使功效喪失，提取效率高。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化石榴根皮中多酚類(lèi)成分的提取工藝，并通過(guò)測(cè)定石榴根皮多酚清除DPPH自由基及ABTS能力，分析其抗氧化活性。為石榴根皮多酚的工業(yè)化生產(chǎn)，促進(jìn)石榴資源的充分開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 采自山東嶧城“萬(wàn)畝石榴園”核心產(chǎn)區(qū)，經(jīng)棗莊學(xué)院閆志佩教授鑒定為正品石榴，手工剝?nèi)∈窀ぃ磧?、干燥后粉碎到?guī)定粒度，備用;沒(méi)食子酸對(duì)照品(純度＞99%，批號(hào):110831－201204) 由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;DPPH、ABTS 美國(guó)Sigma公司;AB－8大孔吸附樹(shù)脂 天津波鴻樹(shù)脂科技有限公司;福林酚、無(wú)水乙醇、碳酸鈉、過(guò)硫酸鈉、抗壞血酸 天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);蒸餾水 棗莊學(xué)院生物學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心提供。

HN－CQY型低溫超聲波萃取儀 上海汗諾儀器有限公司;759型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海奧普勒儀器有限公司;AL204型電子分析天平 瑞士梅特勒公司;FW135型多功能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;RV5型真空泵 英國(guó)Edwards公司;標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚提取及純化工藝 準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎至一定粒度的石榴根皮粉末5.0 g，置于250 mL干燥錐形瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇至一定的料液比例，用保鮮膜封住瓶口。在一定溫度下，按照一定的超聲功率超聲提取一定的時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，將濾液濃縮至30 mL，定容至100 mL。取定容后濾液20 mL，用AB－8大孔吸附樹(shù)脂80 g(濕重)靜態(tài)吸附，50%乙醇250 mL洗脫，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，減壓蒸干后得到石榴根皮多酚固形物，稱(chēng)重，備用［8］。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定 參照文獻(xiàn)［9－10］方法，略有改動(dòng)。精密稱(chēng)取干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品25 mg，用無(wú)水乙醇定容至25 mL，即得濃度為1 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，依次加入福林酚試劑、Na2CO3試劑后，搖勻并定容至25 mL，于25℃下避光反應(yīng)2 h，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A值)，得回歸方程A=0.015C－0.0012(r=0.9996)，濃度在0～48μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.2.3 樣品中多酚的含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取精制后的石榴根皮多酚1.0 mg，用蒸餾水定容至100 mL，作為樣品溶液，用于含量測(cè)定。準(zhǔn)確量取1 mL于25 mL具塞比色管中，按照“1.2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)方法測(cè)定A值，計(jì)算樣品中多酚得率及純度。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 超聲波輔助提取石榴根皮多酚工藝中，主要影響因素有6個(gè)，分別為藥材粒度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間。通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察藥材粒度(10、20、30、40、50、60、70 目)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(0、15%、30%、45%、60%、75%、90%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g/mL))、超聲功率(100、200、300、400、500、600、700 W)、超聲溫度(25、35、45、55、65、75、85 ℃)和超聲時(shí)間(5、15、25、35、45、55、65 min)對(duì)石榴根皮多酚得率的影響，每個(gè)水平重復(fù)3次取平均值計(jì)算分析。試驗(yàn)過(guò)程中的不變水平值為:藥材粒度40目、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲功率400 W、超聲溫度55℃和超聲時(shí)間35 min。

1.2.5 篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)－PB設(shè)計(jì) 藥材粒度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間，依次編碼為 X1、X2、X3、X4、X5和 X6。對(duì)于每個(gè)因素，在前期大量試驗(yàn)基礎(chǔ)上，均設(shè)定高(1)、低(－1)兩個(gè)水平，以石榴根皮多酚得率(Y)為響應(yīng)值，6個(gè)影響因素為自變量，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)平行試驗(yàn)3次，取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果，共進(jìn)行12次試驗(yàn)。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

表1 PB設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels used in the PB design

1.2.6 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)－CCD設(shè)計(jì) 根據(jù)PB試驗(yàn)分析結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2)、超聲溫度(X5)和超聲時(shí)間(X6)作為CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)自變量，以石榴根皮多酚得率(Y)為響應(yīng)值，選用n=20試驗(yàn)設(shè)計(jì)模塊，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)平行試驗(yàn)3次，取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果，建立其與自變量之間的函數(shù)關(guān)系，進(jìn)而尋求石榴根皮多酚提取工藝的最優(yōu)組合。CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 CCD設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels used in the CCD design

1.2.7 石榴根皮多酚清除自由基能力評(píng)價(jià)

1.2.7.1 石榴根皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用 參考文獻(xiàn)［11－14］的方法并加以改進(jìn)，操作方法:準(zhǔn)確吸取100μL稀釋至適當(dāng)濃度的樣品溶液，用重蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL，避光放置30 min，以無(wú)水乙醇作參比在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai;以等體積的無(wú)水乙醇代替樣品溶液，同法操作，測(cè)定吸光度A0;以等體積的無(wú)水乙醇溶液代替DPPH溶液，同法操作，測(cè)定吸光度Ai0。將純化后的石榴根皮提取物依次配制成2.5、5、10、15、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL的樣品溶液，用于對(duì)DPPH自由基的清除作用測(cè)定，求出IC50，并以VC為參照。DPPH自由基清除率按式(3)計(jì)算:

1.2.7.2 石榴根皮多酚對(duì)ABTS+·的清除作用 參照文獻(xiàn)［15－17］的方法并加以改進(jìn)，操作方法:將7 mmol/L的ABTS溶液5 mL與140 mmol/L的過(guò)硫酸鉀88μL混合，置于暗處反應(yīng)24 h，使用前用無(wú)水乙醇稀釋至734 nm波長(zhǎng)下吸光度0.70±0.02，即得ABTS+·稀釋液。分別吸取200μL稀釋至適當(dāng)濃度的樣品溶液，加入4.8 mL ABTS+·稀釋液，避光反應(yīng)15 min，以無(wú)水乙醇作參比在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai;以等體積的無(wú)水乙醇代替樣品溶液，同法操作，測(cè)定吸光度A0;以等體積的無(wú)水乙醇溶液代替ABTS+·溶液，同法操作，測(cè)定吸光度Ai0。將純化后的石榴根皮提取物依次配制成 5、10、15、20、40、80、120、160、200、240、280、320 μg/mL 的樣品溶液，用于對(duì)ABTS的清除作用測(cè)定，求出 IC50，并以 VC為參照。ABTS+·清除率按式(4)計(jì)算:

1.3 數(shù)據(jù)處理

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用 Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件，圖形制作采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，藥材粒度小于40目時(shí)，藥材粉碎越細(xì)，石榴根皮多酚得率越高，當(dāng)藥材粒度為40目時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，此后藥材粉碎越細(xì)，多酚得率反而降低，因此確定藥材粒度為40目左右。乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～60%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，石榴根皮多酚得率呈上升趨勢(shì)，在60%達(dá)到最大值，此后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，多酚得率反而下降，因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%左右。料液比在1∶5～1∶20 g/mL范圍內(nèi)，隨著提取溶劑的增加，石榴根皮多酚得率呈上升趨勢(shì)，在1∶20 g/mL時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著提取溶劑的增加，多酚得率反而下降，因此確定料液比為1∶20 g/mL左右。超聲功率小于400 W時(shí)越大，石榴根皮多酚得率越高，當(dāng)超聲功率為400 W時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，此后隨著超聲功率的增大，多酚得率反而降低，因此確定超聲功率為400 W左右。超聲溫度在25～45℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的提高，石榴根皮多酚得率呈上升趨勢(shì)，在45～55℃時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著超聲溫度的提高，多酚得率反而下降，因此確定超聲溫度為45～55℃。超聲時(shí)間在25～35 min內(nèi)，超聲時(shí)間越長(zhǎng)，石榴根皮多酚得率越高，當(dāng)超聲時(shí)間為25～35 min時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，此后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚得率反而降低，因此確定超聲時(shí)間為25～35 min。

圖1 各因素對(duì)石榴根皮多酚得率的影響Fig.1 Effects of factors on the extraction yield of polyphenols from pomegranate root bark

2.2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件所提供的方案安排試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。將表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 PB設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Arrangement and corresponding results of PB design

由表4可知，模型的p=0.0029＜0.01，達(dá)到極顯著水平，相關(guān)系數(shù) R2=0.9567，決定系數(shù)=0.9048，說(shuō)明模型可信度高，可以應(yīng)用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［18－19］。乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2，p=0.0036＜0.01)、超聲溫度(X5，p=0.0012 ＜0.01)、超聲時(shí)間(X6，p=0.0021＜0.01)3個(gè)因素均達(dá)到極顯著水平，其余因素不顯著(p＞0.05)。因此，在試驗(yàn)中重點(diǎn)優(yōu)化乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間3個(gè)因素。

表4 PB試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis for PB design

注:p＜0.05為差異顯著，p＜0.0001為差異極顯著，p＞0.05為差異不顯著，表6同。從產(chǎn)物得率及節(jié)能環(huán)保等角度考慮，固定藥材粒度為40目、料液比為1∶20 g/mL、超聲功率為300 W。

2.3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

根據(jù)軟件所提供的方案安排試驗(yàn)，對(duì)X2、X5和X6這3個(gè)影響顯著的因素進(jìn)行優(yōu)化分析，結(jié)果見(jiàn)表5。將表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

利用軟件對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性回歸得到二次多項(xiàng)式擬合，預(yù)測(cè)模型如下:

表5 CCD設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Arrangement and corresponding results of CCD design

表6 CCD設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis for CCD design

由表6可以看出，模型p＜0.0001，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)(p=0.0991＞0.05)不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945，決定系數(shù) R2Adj=0.9896，變異系數(shù)0.99%，說(shuō)明該方程擬合度良好，誤差較小，可以應(yīng)用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［19］。一次項(xiàng) X5、X6，二次項(xiàng)及交互項(xiàng)X2X5、X5X6均達(dá)到極顯著水平(p＜0.01)。

響應(yīng)面的坡度變化情況和等高線(xiàn)的稀疏程度均能直觀(guān)反映各因素之間的交互影響情況，等高線(xiàn)呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著［20－21］。由圖2a可知，超聲溫度的曲面變化比乙醇體積分?jǐn)?shù)陡峭，同時(shí)，等高線(xiàn)圖中等溫曲線(xiàn)變化密集程度高，說(shuō)明超聲溫度比乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響大。同理，由圖2b和2c可知，超聲時(shí)間比乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響大，而超聲時(shí)間比超聲溫度對(duì)多酚得率的影響大。

超聲波輔助提取石榴根皮多酚的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60.5%、超聲溫度49.4℃、超聲時(shí)間31.8 min時(shí)，石榴根皮多酚得率模型預(yù)測(cè)值為1.650%，實(shí)際操作中稍作調(diào)整，確定的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度49℃、超聲時(shí)間32 min。測(cè)得石榴根皮多酚平均得率為1.643%，接近預(yù)測(cè)值，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可信。

圖2 各因素交互作用對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面與等高線(xiàn)圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of the yield of polyphenols

2.4 石榴根皮多酚抗氧化活性分析

2.4.1 石榴根皮多酚對(duì)DPPH自由基清除作用 石榴根皮純化物純度約為78%。由圖3可知，在2.5～120μg/mL范圍內(nèi)，石榴根皮對(duì)DPPH自由基的清除率，隨著自身濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)濃度為120μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到70.3%。多酚濃度與對(duì)DPPH自由基清除率之間的擬合的線(xiàn)性方程為y=0.463x+17.05，R2=0.989。通過(guò)擬合方程算出清除作用的 IC50=71.166 μg/mL［22］。鄧娜等［3］研究了石榴其它部位中多酚類(lèi)成分對(duì)DPPH自由基清除作用，結(jié)果表明石榴皮、石榴籽和石榴瓤中多酚類(lèi)成分對(duì)DPPH自由基清除作用的 IC50分別為82.161、110.356和171.987μg/mL，均高于本實(shí)驗(yàn)中石榴根皮多酚的71.166μg/mL?？梢?jiàn)，石榴根皮和石榴其它部位相比，其多酚類(lèi)成分具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖3 石榴根皮多酚及VC對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of polyphenols from pomegranate root bark and VC on DPPH free radical

2.4.2 石榴根皮多酚對(duì)ABTS+·清除作用 由圖4可知，在5～240μg/mL范圍內(nèi)，隨著多酚濃度的增加，其對(duì) ABTS+·的清除率逐漸升高，當(dāng)濃度為240μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到65.7%。多酚濃度與對(duì)ABTS清除率之間的擬合的線(xiàn)性方程為y=0.226x+13.09，R2=0.994。通過(guò)擬合方程算出清除作用的IC50=163.319 μg/mL，范金波等［23］研究了白藜蘆醇、蘆丁和根皮素等多酚類(lèi)成分對(duì)ABTS+·的清除作用，結(jié)果表明3種多酚類(lèi)成分對(duì)ABTS+·清除作用的IC50依次為56.0、138.0和160.0μg/mL，而本實(shí)驗(yàn)中石榴根皮多酚的IC50為163.319μg/mL?？梢?jiàn)，石榴根皮多酚類(lèi)成分對(duì)ABTS+·的清除作用的IC50接近于常見(jiàn)的根皮素類(lèi)成分，具有一定的ABTS+·清除能力。

圖4 石榴根皮多酚及VC對(duì)ABTS的清除作用Fig.4 Scavenging effects of polyphenols from pomegranate root bark and VC on ABTS

3 結(jié)論

本課題以石榴根皮為材料，采用 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合Central Composite Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出超聲波輔助提取石榴根皮多酚最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度49℃、超聲時(shí)間32 min，按照此工藝進(jìn)行試驗(yàn)操作，得到多酚平均得率為1.643%，這與理論值1.650%相符，表明所選用的回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合較好。石榴根皮多酚抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，石榴根皮中多酚類(lèi)成分具有較好的清除DPPH自由基和ABTS+·能力，其IC50相應(yīng)為71.166μg/mL和163.319μg/mL。其在一定的濃度范圍內(nèi)，石榴根皮多酚與抗氧化活性之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，石榴根皮多酚具有一定的抗氧化活性。本研究為石榴根皮的充分開(kāi)發(fā)利用，助力于石榴資源的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了理論支撐。