吳少敏， 關(guān)靈， 鄭銳年， 黃素然

東莞市人民醫(yī)院 1婦產(chǎn)科， 2藥物臨床試驗機(jī)構(gòu)辦， 3腫瘤內(nèi)科(廣東東莞 523000)

近四十年，盡管宮頸癌的發(fā)病率和病死率在全世界范圍內(nèi)均已明顯下降，但其仍然是造成女性死亡的主要腫瘤[1-2]。據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，每年有大約120 000例女性患者死于宮頸癌[3]。宮頸癌起病隱匿，位置特殊，涉及隱私，患者發(fā)現(xiàn)時常常已進(jìn)展到中晚期，喪失了手術(shù)根治的機(jī)會[4]。目前，同期放化療是治療局部晚期宮頸癌的主要手段之一。研究結(jié)果[5-6]顯示以順鉑為基礎(chǔ)的同步放化療較單純放療可以降低宮頸癌患者的局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率, 改善患者生存率, 使死亡危險下降 30%～50%。因此，在放療的同時，加用順鉑為主的化療，是治療局部晚期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。但是，研究表明順鉑同期放化療的治療效果存在明顯個體差異。韓超等[7]研究發(fā)現(xiàn)，以順鉑為主的同步放化療組與單純放療組相比，有效率和 5 年生存率均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是，Ⅲ期以上、病理分級G3、鱗癌的患者5 年生存率可明顯延長。Park 等[8]回顧性分析發(fā)現(xiàn)，對于老年局部晚期宮頸癌患者，同步放化療與單純放療比較，并不能提高癌癥特異生存率。上述研究說明，順鉑在宮頸癌中應(yīng)用治療效果存在明顯的差異，進(jìn)而說明部分宮頸癌患者在承受化療的毒副反應(yīng)以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)時，卻沒有得到治療效果。順鉑是宮頸癌化療耐藥的主要藥物之一[9]。其主要與細(xì)胞內(nèi)部DNA發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而引起DNA單鏈損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不同機(jī)體應(yīng)對順鉑引起DNA損傷的差異是影響宮頸癌患者順鉑耐藥的主要因素[10-11]。因此，深入探討DNA損傷應(yīng)答的個體差異性對指導(dǎo)臨床宮頸癌個性化治療具有重要意義。在機(jī)體應(yīng)對DNA損傷應(yīng)答的過程中，DNA切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1)是DNA堿基切除修復(fù)(NER)途徑中的關(guān)鍵酶，可以清除致癌物(如煙草)及抗癌劑(如順鉑)使用所導(dǎo)致的DNA損傷廢物[12]。ERCC1的單核苷酸多態(tài)性與化療耐藥的關(guān)系已有報道，但是C118T與化療耐藥的關(guān)系暫無報道[1]。為進(jìn)一步豐富ERCC1多態(tài)性(C118T)與宮頸癌耐藥間的臨床資料，我們統(tǒng)計了我院診治的102例晚期宮頸癌患者順鉑化療療效，同時檢測外周血ERCC1基因多態(tài)性(C118T)比例，分析ERCC1基因多態(tài)性(C118T)與宮頸癌順鉑耐藥間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究連續(xù)收錄2012年1月至2017年5月東莞市人民醫(yī)院收治的晚期宮頸癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均行病理學(xué)檢查確診；(2)符合NCCN 2017版宮頸癌分期的Ⅱb～Ⅳ期患者；(3)確診至化療結(jié)束患者未接受手術(shù)、放射、生物、中藥等其他方法治療，且化療過程中未出現(xiàn)其他不良反應(yīng)；(4)預(yù)計壽命大于3個月。入院后完善術(shù)前檢查，血常規(guī)、凝血功能、血生化、心電圖大致正常；重要臟器如心、肝、肺、腎等功能良好，無嚴(yán)重合并癥，能夠耐受化學(xué)藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重惡液質(zhì)的患者；(2)患有其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的患者；(3)中途更改治療方案的患者。并排除化療前骨髓功能不佳的患者[白細(xì)胞計數(shù) <2.0×109·L-1和(或)血小板計數(shù)<80×109·L-1]；入組前曾接受過其他方案化療的患者。共有102例患者最終被納入研究對象中，年齡31～60歲，中位年齡為49歲，其中Ⅱb期58例，Ⅲ期34例，Ⅳ期10例；鱗癌92例，其中高分化61例，中低分化31例；腺癌10例，其中高分化4例，中低分化6例。所有患者均已簽署東莞市人民醫(yī)院臨床試驗知情同意書。所有試驗步驟均符合東莞市人民醫(yī)院倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 檢查方法 在接受化療前，均行B超檢查測量患者腫瘤大小。每周期化療結(jié)束以及后續(xù)隨訪，均行B超重新測量患者腫瘤大小。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，將腫瘤化療療效分為以下幾個等級：(1)疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)；(2)疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)；(3)完全緩解(complete response，CR)；(4)部分緩解(partial response，PR)。將CR+PR定義為化療敏感組；PD+SD定義為化療耐藥組。

1.2.2 化療方法 所有患者均接受紫杉醇聯(lián)合順鉑(TP)和紫杉醇聯(lián)合卡鉑TC方案的化療，21 d為1個療程，共進(jìn)行2～3個療程。

1.2.3 標(biāo)本采集及DNA提取 患者簽署知情同意書后，抽取兩組研究對象外周血2 mL，用TIANamp Blood血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化，中國)按說明書提取基因組DNA。

1.2.4 ERCC1基因多態(tài)性檢測 對各個標(biāo)本的全血DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物合成：ERCC1基因序列從NCBI獲得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。采用Primer5.0軟件設(shè)計C118T引物，正向：5′-AGCAGCGCCCTCTGTGGTTATC-3′；反向：5′-AGGCTTCTCATAGAAC-3′。所有引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：50 μL，總體系中包含基因組DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，dNTP(0.2 mmol/L) Mixture 8 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2+Plus) 5 μL，TaKaRa LA Taq (5 U/μL) 0.5 μL。反應(yīng)程序均為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，在55℃下退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察并拍照，800 bp出現(xiàn)亮帶后送北京華大基因公司測序。測序結(jié)果用DNASTAR軟件包中的Seqman進(jìn)行序列分析，用其中的MegAlign進(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)序列的比對，最終計算出化療敏感組和耐藥組的基因型突變頻率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，不同組別間采用2檢驗及t檢驗，基因型及等位基因間發(fā)生化療耐藥的相對危險度用比值比(odds ratio，OR)及95%的可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

純合子CC型的基因顯著存在于化療敏感組(P<0.05)；兩組間雜合子TC型基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而TT型基因顯著存在于化療耐藥組(P<0.05)；化療耐藥組T等位基因頻率顯著高于化療敏感組(P<0.05)。提示ERCC1基因(C118T)單核苷酸多態(tài)性可能與化療耐藥相關(guān)。因此，為進(jìn)一步探究ERCC1基因的基因型頻率及等位基因頻率與化療耐藥間的關(guān)系，我們分別分析了兩組試驗者內(nèi)ERCC1基因(C118T)基因型頻率及等位基因頻率與順鉑化療耐藥間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，相比于化療敏感組，攜帶有突變基因T的基因型顯著存在于化療耐藥組(P<0.05)；同時，化療耐藥組T等位基因頻率顯著高于化療敏感組(P<0.05)。ERCC1基因多態(tài)性(C-T突變)與順鉑化療耐藥間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1～3。

表1 各組ERCC1基因分型 例(%)

表2 ERCC1不同基因型化療耐藥結(jié)果例(%)

表3 ERCC1基因等位基因頻率化療耐藥結(jié)果頻數(shù)(%)

3 討論

宮頸癌是影響女性生命健康的主要疾病之一。隨著其發(fā)病率的日益增長，目前越來越受到醫(yī)務(wù)人員的關(guān)注?；熓侵型砥趯m頸癌患者的主要治療手段。順鉑是常用的藥物之一。在取得緩解的基礎(chǔ)上，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)存在順鉑耐藥，具體表現(xiàn)為宮頸癌患者PD和SD顯著延長。因此針對宮頸癌順鉑化療耐藥的研究具有重要社會醫(yī)學(xué)意義。

藥物療效存在個體差異一直是臨床常見的現(xiàn)象，也是臨床醫(yī)生關(guān)注的問題。隨著分子遺傳學(xué)與分子藥理學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到不同個體對同一藥物的不同反應(yīng)大多來源于基因的差異?；熌退幏譃楣逃心退幒屠^發(fā)耐藥。前者指患者在服用化療藥物之前就存在對藥物的抵抗；而后者則指患者在服用化療藥物的同時，隨著服用次數(shù)的增多，逐漸出現(xiàn)藥物脫敏，即對藥物呈現(xiàn)低敏感[13]。兩種不同耐藥類型，對應(yīng)不同的干預(yù)手段。宮頸癌順鉑耐藥為繼發(fā)耐藥，故我們從順鉑對細(xì)胞引起的下游信號途徑入手。順鉑對腫瘤的細(xì)胞毒作用主要是通過形成鉑-DNA加合物。順鉑的主要作用靶點是DNA。順鉑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后水解為雙氯雙氨鉑，然后與細(xì)胞DNA形成順鉑-DNA加合物，影響細(xì)胞DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致DNA損傷。順鉑形成的加合物主要是1,2鏈間交聯(lián)，少數(shù)為1,3鏈間交聯(lián)，長鏈交聯(lián)劑DNA交聯(lián)。但不同患者應(yīng)對順鉑所致DNA損傷修復(fù)程度不同，是引起患者間順鉑治療差異性的主要原因。細(xì)胞修復(fù)順鉑所致單鏈損傷的途徑主要為DNA堿基切除修復(fù)。在此過程中，ERCC1是DNA堿基切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵酶。該基因定位于染色體 19q13.2～13.3，其正常表達(dá)是維持該修復(fù)酶功能的分子基礎(chǔ)。此酶發(fā)生突變，則影響DNA堿基切除修復(fù)的程度。研究顯示，ERCC1基因可以通過多種方式影響腫瘤耐藥。ERCC1低表達(dá)常常提示宮頸癌的不良預(yù)后[1]。不同的個體由于ERCC1基因存在不同的多態(tài)性，其DNA的核苷酸切除修復(fù)能力也不同, 從而表現(xiàn)為對鉑類藥物的敏感性不同。ERCC1核苷酸多態(tài)性 C118T已在多種腫瘤，如大腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌的鉑劑化療耐藥中起重要作用[14-16]。研究指出，該種核苷酸多態(tài)性可以作為多種腫瘤化療效果的預(yù)測因子。為進(jìn)一步豐富ERCC1多態(tài)性與宮頸癌順鉑耐藥間的臨床資料，我們發(fā)現(xiàn)CC型的ERCC1顯著存在于化療敏感組，而TT型基因顯著存在于化療耐藥組。進(jìn)一步顯示，與化療敏感組相比，TT及TC基因型的患者發(fā)生耐藥的可能性更高，T等位基因攜帶者更容易發(fā)生化療耐藥。而有研究表明，T等位基因是宮頸癌易感的一個風(fēng)險因素，而在卵巢癌細(xì)胞系中，T等位基因與ERCC1 mRNA低表達(dá)相關(guān)，提示T等位基因可能降低DNA修復(fù)能力[17-18]。

遺傳多態(tài)性可以影響蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及折疊。ERCC1基因的多態(tài)性同樣可以影響其基因表達(dá)量，從而在各種腫瘤的化療反應(yīng)中起作用。有研究報道，在晚期的非小細(xì)胞肺癌中，ERCC1核苷酸多態(tài)性C118T與患者對順鉑化療反應(yīng)密切相關(guān)[19]。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，CC基因型的患者對化療敏感的比例要2倍于TT及TC基因型的患者。相反，在一項關(guān)于ERCC1核苷酸多態(tài)性C118T與進(jìn)展期卵巢上皮癌患者順鉑化療敏感性關(guān)系的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)兩者并無相關(guān)性[20]。因此，對于兩者關(guān)系的現(xiàn)象確認(rèn)及潛在機(jī)制研究是十分必要的。

同時，本研究尚存在較多局限性。首先，研究樣本僅包含102例患者，樣本含量相對偏少；其次，僅僅將化療的療效作為觀測的指標(biāo)，而缺乏無病生存期及總生存期的數(shù)據(jù)，無法對該基因多態(tài)性與疾病總體進(jìn)展進(jìn)行分析；再次，患者在化療過程中，其病理分化水平，是否結(jié)合其他治療方式及護(hù)理水平等因素同樣應(yīng)該被考慮到最終結(jié)果的有效性中。最后，單一基因的核苷酸多態(tài)性往往伴隨其他的基因突變共同對化療耐藥起作用。

綜上所述，本研究通過比較102例患者外周血ERCC1核苷酸多態(tài)性C118T與宮頸癌順鉑耐藥間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與順鉑化療耐藥間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，進(jìn)一步豐富ERCC1多態(tài)性C118T與宮頸癌順鉑耐藥間的臨床資料，并為今后宮頸癌個體化治療提供了更多理論支撐。