王正玲， 宋玉寧， 程玉清

濰坊市益都中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(山東濰坊 262500)

癲癇是嚴(yán)重影響健康和生存質(zhì)量的疾病，通過動(dòng)物模型研究可探討癲癇的發(fā)病、發(fā)展及其機(jī)制，而大鼠和小鼠為其常用動(dòng)物模型[1-3]。癲癇的發(fā)生發(fā)展涉及過個(gè)細(xì)胞因子，已有研究表明，谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)和Toll樣受體4(TLR4)在癲癇中的表達(dá)異常[4-5]。然而具體GADA和TLR4在癲癇及其神經(jīng)元損傷中的作用尚不明確，需進(jìn)一步研究證實(shí)。因此，2017年5—12月本研究建立了癲癇小鼠模型，檢測了其血清GADA和TLR4水平變化并分析了其血清GADA和TLR4水平與海馬神經(jīng)元損傷情況的關(guān)系，具體研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 研究采用3月齡CD-1小鼠60只，由解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均為雄性，體重20～33 g，平均(25.88±3.56)g。所有小鼠均獨(dú)立飼養(yǎng)在22～24℃環(huán)境中，保持12 am/12 pm的明/暗周期，自由攝食和飲水，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料由北京中興飼料公司提供，引用純凈水由杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司提供。研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)審核批注。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑 氯化鋰、匹羅卡品購于美國Sigma公司；乙醚購于南京沃潔特化工科技有限公司；抗GADA試劑盒購于美國Biomerica公司；TLR4正義和反義序列購于廣州RIBIBIO公司；RNA提取試劑盒購于德國Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Promega公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq購于日本TaKaRa公司；離心管、玻璃瓶、吸管、試管等購于廣東東普醫(yī)療科技有限公司；Synergy H1全功能酶標(biāo)儀購于美國伯騰儀器有限公司；Centrifuge 5920R離心機(jī)、微量移液器購于德國艾本德公司；戊巴比妥鈉購于北京普博斯生物科技有限公司；多聚甲醛購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酒精購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司；BM-V1生物組織冷凍包埋機(jī)、TS-12F生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、電子天平購于孝感市電子儀器廠；RM2125切片機(jī)購于德國LEICA公司；二甲苯、二氨基聯(lián)苯胺、磷酸鹽緩沖液、冰醋酸AR級、枸椽酸緩沖液購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司；蘇木精-伊紅購于美國Fisher公司；過氧化氫、辣根過氧化物酶、牛血清購于北京博奧森生物公司；細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購于美國羅氏公司；電熱恒溫水浴箱HH-W420 OLABO購于山東博科科學(xué)儀器有限公司；微波爐購于中國美的公司；低溫冰箱購于中國海爾公司；ANTI-MOUL光學(xué)顯微鏡購于日本Nikon公司；純水儀購于美國Millipore公司；SPOT INSIGHT GOLO照相系統(tǒng)購于日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組和小鼠癲癇模型構(gòu)建 常規(guī)乙醚麻醉后將小鼠固定，A組30只小鼠通過腹腔注射3 mEq/kg的氯化鋰、10 h后腹腔注射溴化甲基阿托品10 mg/kg、30 min后腹腔注射300 mg/kg的匹羅卡品[劑型∶注射劑，規(guī)格：1 mL∶10 mg(硝酸鹽)]構(gòu)建小鼠癲癇模型，大鼠持續(xù)癲癇發(fā)作1 h或抽搐瀕危時(shí)腹腔注射地西泮4 mg/kg，無緩解者可重復(fù)地西泮注射，最多重復(fù)注射2次所有小鼠均癥狀緩解，小鼠均癲癇發(fā)作Ⅳ級以上且解除癥狀后狀態(tài)良好，成功建立小鼠癲癇模型。B組30只小鼠同期通過腹腔注射等量生理鹽水建立空白對照。

1.3.2 血清樣本的獲取和相關(guān)指標(biāo)的檢測 分別在兩組建模前及建模1、3 d取尾靜脈血1 mL以檢測血清GADA和TLR4水平，獲得的血液標(biāo)本以3 500 r/min、3.5 cm半徑離心、4℃中離心5 min，待分層后取上層血清常規(guī)冷藏待測。血清GADA水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，具體檢測操作根據(jù)酶標(biāo)儀以及相關(guān)試劑盒說明書要求進(jìn)行。血清TLR4水平檢測采用RT-PCR法，具體檢測操作見參考文獻(xiàn)[6]。

1.3.3 海馬神經(jīng)元損傷情況的檢測 建模3 d后向小鼠腹腔注射40 mg/kg的1%戊巴比妥鈉麻醉，隨后迅速進(jìn)行斷頭以處死小鼠，掀開顱骨暴露腦組織，剝離大腦皮層以顯露海馬組織，游離其相鄰組織并迅速取出海馬組織，采用4%多聚甲醛固定1 d，流水沖洗1 h后梯度酒精脫水，并常規(guī)行石蠟包埋，切制成厚度為3 μm的連續(xù)切片待測。常規(guī)行HE染色觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞變化。并通過TUNEL染色法檢測觀察海馬神經(jīng)元損傷狀況，具體檢測操作見參考文獻(xiàn)[7]。顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞核染色，結(jié)合染色為棕黃色顆粒為TUNEL陽性以及細(xì)胞的形態(tài)特征確定凋亡細(xì)胞，在400高倍顯微鏡下觀察，每個(gè)檢測樣本隨機(jī)觀察5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)算單位面積內(nèi)TUNEL細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)神經(jīng)損傷狀況以及凋亡神經(jīng)元數(shù)。

1.4 評價(jià)方法 癲癇發(fā)作分級[8]：根據(jù)驚厥發(fā)作情況分為0～Ⅴ級，其中0級為未表現(xiàn)出發(fā)作跡象，Ⅰ級為出現(xiàn)頭面部痙攣，Ⅱ級為出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭或濕狗樣抖動(dòng)，Ⅲ級為前肢陣攣但無后肢站立，Ⅳ級為后肢站立且全身強(qiáng)直驚厥，Ⅴ級為后肢站立伴摔倒，且出現(xiàn)全身強(qiáng)直-陣攣。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布并采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，Pearson線性相關(guān)分析法分析小鼠癲癇模型血清GADA和TLR4水平與其海馬神經(jīng)元壞死的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組建模前后血清GADA和TLR4水平比較 兩組建模前血清GADA和TLR4水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與B組比較，A組建模1 d和建模3 d的血清GADA和TLR4水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組建模前后血清GADA和TLR4水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與建模前比較，A組建模1 d和建模3 d的血清GADA和TLR4水平均升高，且A組建模3 d的血清GADA和TLR4水平高于其建模1 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1兩組建模前后血清GADA和TLR4水平比較

項(xiàng)目n建模前建模1 d建模3 dGADA滴度TLR4 mRNA相對表達(dá)量GADA滴度TLR4 mRNA相對表達(dá)量GADA滴度TLR4 mRNA相對表達(dá)量A組300.75±0.090.16±0.080.86±0.09?0.38±0.09?0.98±0.12?△0.55±0.13?△B組300.73±0.080.15±0.070.74±0.060.16±0.080.73±0.070.14±0.05t值0.9100.5156.07610.0079.85716.123P值>0.05>0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

*與同組建模前比較P<0.05；△與同組建模1 d比較P<0.05

2.2 兩組海馬神經(jīng)元損傷情況以及凋亡神經(jīng)元數(shù)比較 B組均未見海馬神經(jīng)元損傷，海馬神經(jīng)元排列整齊緊密，細(xì)胞漿透明，細(xì)胞核呈圓形且核仁清晰，細(xì)胞形態(tài)正常。A組所有大鼠均出現(xiàn)不同程度的海馬神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元排列出現(xiàn)散亂，細(xì)胞邊緣欠清晰，核固縮，胞體濃縮，部分胞漿紅染。B組凋亡神經(jīng)元少量。A組凋亡神經(jīng)元數(shù)在25.44～37.28 Nr/5F，平均(31.15±6.88)Nr/5F。見圖1。

圖1 兩組海馬神經(jīng)元的病理圖(×400)

2.3 A組凋亡神經(jīng)元數(shù)<31.15 Nr/5F與≥31.15 Nr/5F建模前后的血清GADA和TLR4水平比較 A組凋亡神經(jīng)元數(shù)<31.15 Nr/5F與凋亡神經(jīng)元數(shù)≥31.15 Nr/5F鼠建模前血清GADA和TLR4水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與A組凋亡神經(jīng)元數(shù)<31.15 Nr/5F比較，A組凋亡神經(jīng)元數(shù)≥31.15 Nr/5F建模1 d和建模3 d的血清GADA和TLR4水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

凋亡神經(jīng)元數(shù)(Nr/5F)n建模前建模1 d建模3 dGADA滴度TLR4 mRNA相對表達(dá)量GADA滴度TLR4 mRNA相對表達(dá)量GADA滴度TLR4 mRNA相對表達(dá)量≥31.15180.76±0.090.17±0.090.92±0.110.45±0.121.05±0.130.67±0.12<31.15120.74±0.070.15±0.060.77±0.080.28±0.050.88±0.090.37±0.09t值0.6490.6744.0534.6263.9347.372P值>0.05>0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.4 小鼠癲癇模型血清GADA和TLR4水平與其凋亡神經(jīng)元數(shù)的關(guān)系分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，小鼠癲癇模型血清GADA和TLR4水平與其凋亡神經(jīng)元數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.822、0.879，P<0.05)。

3 討論

近年來，各類原因?qū)е掳d癇的發(fā)生不斷增加，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。作為慢性神經(jīng)系統(tǒng)病癥，癲癇的治療困難，而且治療可反復(fù)發(fā)作，病程長，可給患者帶來明顯的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)，影響其生存質(zhì)量[9-10]。因此，對癲癇的機(jī)制進(jìn)行研究，從而指導(dǎo)臨床采取措施和開發(fā)藥物以控制癲癇病情具有重要意義。而癲癇的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制目前主要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究[11]。成功建立動(dòng)物模型為癲癇研究的重要環(huán)節(jié)，本研究通過腹腔注射匹羅卡品法構(gòu)建小鼠癲癇模型的結(jié)果顯示，研究所有小鼠的癲癇發(fā)作Ⅳ級以上，建模成功，腹腔注射匹羅卡品法為構(gòu)建小鼠癲癇模型的有效方法。癲癇不但在發(fā)作時(shí)可對患者造成明顯的影響，其相關(guān)神經(jīng)元損傷亦是其影響患者的重要因素[12]。海馬為癲癇最敏感腦區(qū)之一，臨床已有多個(gè)研究證實(shí)癲癇患者可存在海馬神經(jīng)元損傷的發(fā)生[13]。本研究亦建立了小鼠癲癇模型以觀察其海馬神經(jīng)元損傷狀況，本研究結(jié)果顯示，癲癇小鼠均出現(xiàn)不同程度的海馬神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元排列出現(xiàn)散亂，細(xì)胞邊緣欠清晰，核固縮，胞體濃縮，部分胞漿紅染，而凋亡神經(jīng)元數(shù)在25.44～37.28 Nr/5F，平均(31.15±6.88)Nr/5F，其神經(jīng)元凋亡率高，海馬神經(jīng)元損傷嚴(yán)重。預(yù)防和改善癲癇患者海馬神經(jīng)元損傷病情為其治療的重要環(huán)節(jié)。

癲癇的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)機(jī)制，對其各機(jī)制相關(guān)因子進(jìn)行檢測可能有助于了解其病理機(jī)制而指導(dǎo)臨床干預(yù)。GADA為與自身免疫密切相關(guān)因子，而癲癇與自身免疫異常相關(guān)，因此GADA與癲癇亦具有一定的關(guān)系，這一點(diǎn)已得到臨床研究認(rèn)可[14]。亦有研究證實(shí)免疫炎癥在癲癇發(fā)生、發(fā)展中具有明顯的促進(jìn)作用，而TLR4可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，其與癲癇的關(guān)系亦得到了多個(gè)研究的認(rèn)可[15-16]。然而目前關(guān)于GADA和TLR4與癲癇患者的海馬神經(jīng)元損傷具體關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究檢測了小鼠癲癇模型的血清GADA和TLR4水平，本研究結(jié)果顯示小鼠癲癇模型血清GADA和TLR4水平均較高，而隨著建模后時(shí)間的延長，小鼠血清GADA和TLR4水平進(jìn)一步升高，進(jìn)一步證實(shí)GADA和TLR4與癲癇發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。而本研究中凋亡神經(jīng)元數(shù)≥31.15 Nr/5F小鼠建模1 d和建模3 d的血清GADA和TLR4水平高于其凋亡神經(jīng)元數(shù)<31.15 Nr/5F小鼠，提示其血清GADA和TLR4水平與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況可能相關(guān)。進(jìn)一步的Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，小鼠癲癇模型血清GADA和TLR4水平與其凋亡神經(jīng)元數(shù)均呈正相關(guān)，小鼠癲癇模型血清GADA和TLR4水平的檢測可能有助于輔助評估其海馬神經(jīng)損傷狀況，而采取措施控制炎癥反應(yīng)和提高免疫力可能為改善癲癇療效和防治其神經(jīng)元損傷的重要措施。

綜上所述，小鼠癲癇模型血清GADA和TLR4水平與其海馬神經(jīng)元損傷具有明顯的相關(guān)性，可能用于其海馬神經(jīng)元損傷評估以指導(dǎo)臨床防治癲癇海馬神經(jīng)元損傷，減少其海馬神經(jīng)元損傷相關(guān)認(rèn)知功能損傷和治療支出，提高癲癇治療水平。