沈琦， 周繼豪， 張睿婷， 張新友

深圳市人民醫(yī)院、暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院血液內(nèi)科(廣東深圳 518020)

腫瘤治療基因藥物是近10年來國內(nèi)外研究的重點之一，主要包括反義核酸和siRNA。通過基因芯片、高通量測序等方法尋找腫瘤細(xì)胞株或原代細(xì)胞高表達(dá)基因，通過多疾病綜合分析篩選特異基因，設(shè)計相應(yīng)的反義核酸或特異干擾性小分子RNA(small interfering RNA，siRNA)，再利用多種實驗方法篩選有效高效的片段[1-4]。由于轉(zhuǎn)染反義核酸或特異siRNA能特異地沉默目的基因，且作用具有高效性和高特異性的特點，使RNA干擾成為腫瘤治療領(lǐng)域中的新希望。PPP2R5C是蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的一個亞單位，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起重要作用，許多細(xì)胞的活動過程是依賴于關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化狀態(tài)。PPP2R5C作為PP2A重要的一個亞單位，其表達(dá)模式變化或基因突變等可能影響了正常細(xì)胞的增殖或?qū)е录?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化等[5-6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)通過PPP2R5C-siRNA下調(diào)PPP2R5C基因，對慢性髓細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞(K562細(xì)胞株及伊馬替尼耐藥的K562R細(xì)胞株)、Jurkat細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的增殖抑制和凋亡增加等影響[7-8]，即對慢性粒細(xì)胞白血病及T淋巴白血病細(xì)胞的惡性克隆起到抑制作用，若能應(yīng)用于臨床，需驗證PPP2R5C-siRNA安全性，目前對其安全性的分析還少見報道。故2013年5月至2017年5月，本研究擬分析核轉(zhuǎn)染PPP2R5C后，CML細(xì)胞株單個細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變以及健康人骨髓單個核細(xì)胞體外增殖、分化的情況，初步證明PPP2R5C-siRNA安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 K562細(xì)胞株(人慢性髓原白血病細(xì)胞，購自上海細(xì)胞庫，本科室保存)，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)及細(xì)胞免疫學(xué)排除血液系統(tǒng)相關(guān)疾病的健康人3例，年齡25～41歲，中位年齡33歲。

1.1.2 主要試劑 TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒PowerScriptTMReverse購自美國Becton Dickinton公司，Real Master Mix試劑盒購自北京Tiangen公司。注射用重組人促紅細(xì)胞生成素(EPO)購自深圳賽保爾制藥有限責(zé)任公司，注射用重組人促血小板生成素(TPO)購自沈陽三生制藥有限責(zé)任公司，重組人IL-3、干細(xì)胞因子(SCF)購自美國Gibco公司，注射用重組人粒-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)購自廈門特寶生物工程股份有限公司，Suspension cell lines NucleofectorTMKit 購自德國Amaxa公司。

1.1.3 主要儀器 原子力顯微鏡購自O(shè)lympus公司，PCR擴增儀購自德國Biometra公司，熒光實時定量PCR儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PPP2R5C-siRNA的設(shè)計、合成及工作液的配置 在Invitrogen公司網(wǎng)站設(shè)計目的基因不同序列的siRNA[7]。

1.2.2 原子力顯微鏡檢測細(xì)胞形態(tài)

1.2.2.1 樣品制備 分別取轉(zhuǎn)染72 h后不同實驗組(siRNA:轉(zhuǎn)染PPP2R5C-siRNA的K562細(xì)胞；MOCK:空轉(zhuǎn)的K562細(xì)胞；NC:未經(jīng)處理的K562細(xì)胞)的細(xì)胞，甲醛固定，室溫自然干燥。

1.2.2.2 原子粒顯微鏡(AFM)成像及力譜測量 選用100 μm掃描器，UL20B硅探針，力常數(shù)為2.8 N/m[9]。

1.2.3 骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)的分離 應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液，具體方法同單個核細(xì)胞提取。

1.2.4 核轉(zhuǎn)染正常人BM-MNCs 按照Amaxa公司推薦的方法，收集正常人BM-MNCs達(dá)到4×106，用NucleofectorTMSolution和Supplement以9∶2配得的混合液懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞及1 μg siRNA加入核轉(zhuǎn)杯，選擇對應(yīng)的程序，程序完成后立刻用專用的移液管將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至12孔板中。

1.2.5 熒光實時定量PCR檢測各組PPP2R5C基因mRNA表達(dá)水平 (1)分別收集 K562組(K562細(xì)胞株)、MNC組(健康人骨髓單個核細(xì)胞)及轉(zhuǎn)染PPP2R5C-siRNA至健康人骨髓單個核細(xì)胞 24 h的MNC-siRNA組、空轉(zhuǎn)組(MNC-MOCK)的細(xì)胞，提取RNA，合成cDNA。(2)熒光實時定量PCR應(yīng)用Real Master Mix試劑盒。總反應(yīng)體系20 μL，具體反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s，55℃ 30 s，81℃讀板。(3)采用相對定量法分別分析PPP2R5C基因相對mRNA的表達(dá)水平，以β2M為內(nèi)參，利用Ct值，計算PPP2R5C基因相對mRNA表達(dá)量，其計算公式為：相對mRNA表達(dá)量=2-△Ct×100%，其中，△Ct=Ct(PPP2R5C)-Ct(β2M)。

1.2.6 紅細(xì)胞集落形成能力(BFU-E)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成能力(CFU-GM)和巨核細(xì)胞集落形成能力(CFU-Meg)檢測

1.2.6.1 種板 24孔板培養(yǎng)板，分轉(zhuǎn)染PPP2R5C-siRNA的健康人骨髓單個核細(xì)胞組(siRNA)及空轉(zhuǎn)的健康人骨髓單個核細(xì)胞組(MOCK)，BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg各3孔，每孔0.5 mL體系，其中，125 μL的甲基纖維素，BFU-E(細(xì)胞因子應(yīng)用EPO，終濃度30 IU/mL)、CFU-GM(細(xì)胞因子應(yīng)用GM-CSF，終濃度10 ng/mL)、CFU-Meg(細(xì)胞因子應(yīng)用TPO，終濃度50 ng/mL)。此外，細(xì)胞因子SCF(終濃度30 ng/mL)、IL-3(終濃度100 IU/mL)。新生牛血清(終體積百分?jǐn)?shù)15%)，RPMI 1640培養(yǎng)基補足體系。

1.2.6.2 計數(shù) 14 d后在顯微鏡下觀察計數(shù)，BFU-E計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為>50個細(xì)胞計為1個集落，CFU-GM計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為>40個細(xì)胞計為1個集落，CFU-Meg計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為>3個細(xì)胞計為1個集落。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，組間比較選用多個樣本均數(shù)間兩兩均數(shù)比較的S-N-K(q檢驗)；不同樣本中PPP2R5C基因mRNA水平的比較采用非參數(shù)檢驗中的多樣本比較的秩和檢驗(H值檢驗)；健康人BM-MNCs體外誘導(dǎo)分化的比較采用兩樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)均為：α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AFM觀察各組細(xì)胞微觀形態(tài)學(xué)變化 利用AFM觀察轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞，所有細(xì)胞均呈橢圓形，見圖1。與各對照組相比，干擾組細(xì)胞高度和直徑有所減小，但各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

siRNA：干擾組，MOCK：空轉(zhuǎn)組；NC:陰性對照

項目 siRNAMOCKNC細(xì)胞高度3.01±0.273.19±0.143.21±0.23細(xì)胞半徑5.49±0.125.72±0.058.58±0.21

2.2 健康人BM-MNCs中PPP2R5C基因表達(dá)情況 3例健康人BM-MNCs中的PPP2R5C基因表達(dá)(6.839±1.342)%明顯低于K562(34.215±3.756)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染前(MNC)后(MNC-siRNA)(4.704±1.862)%以及與空轉(zhuǎn)組(MNC-MOCK)(4.887±2.235)%對比BM-MNCs中PPP2R5C基因表達(dá)量無明顯變化。見圖2。

圖2轉(zhuǎn)染前后健康人BM-MNCs及K562中PPP2R5C基因的表達(dá)水平

2.3 健康人BM-MNCs體外BFU-E、CFU-GM和CFU-Meg形成情況 PPP2R5C-siRNA轉(zhuǎn)染、種板后14 d，健康人BM-MNCs體外BFU-E(116±22)、CFU-GM(168±18)、CFU-Meg(76±5)的形成與MOCK對照組(123±14、177±11、84±7)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.723、0.826、0.448)，各組集落圖及計數(shù)結(jié)果分別見圖3、4。

圖3 1例健康人BM-MNCs體外誘導(dǎo)分化圖(14 d 倒置顯微鏡，種板密度2×105)

圖4 體外誘導(dǎo)14 d各組BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg形成情況

3 討論

近年來，惡性腫瘤的治療領(lǐng)域已開啟了針對患者個體基因組學(xué)的靶向治療和個體化治療新時代。RNA干擾能高效特異沉默靶基因，已成為腫瘤靶向治療的一種革命性的新手段[10]。RNA干擾通過病毒性載體或非病毒載體轉(zhuǎn)染入某種細(xì)胞中，通過CCK8、實時定量PCR、Western blot等方法來認(rèn)識目的基因的功能。病毒性載體與非病毒性載體相比，具有目的基因轉(zhuǎn)染效率高、基因表達(dá)穩(wěn)定持久等優(yōu)點，其局限性體現(xiàn)在病毒載體存在生物安全性問題，逆轉(zhuǎn)錄病毒可能與靶細(xì)胞基因組隨機整合，而且只能感染分裂期細(xì)胞等問題。非病毒性表達(dá)載體目前主要通過電穿孔和脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法，但不同類型細(xì)胞對外源DNA的攝取能力有所不同，因而此方法對于懸浮細(xì)胞和原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果較差。

本研究采用的是德國Amaxa公司所推出的NucleofectorTM核轉(zhuǎn)染方法，是一種新的非病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，該技術(shù)針對不同細(xì)胞有推薦的高轉(zhuǎn)染效率或高細(xì)胞活性的方法代碼轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染緩沖液，在核轉(zhuǎn)儀上輸入代碼即可完成轉(zhuǎn)染過程[11-12]。轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染緩沖液能增強細(xì)胞膜通透性，轉(zhuǎn)染啟動時瞬時的電流能同時穿透細(xì)胞膜和核膜，直接將外源核酸同時輸送到細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)。此技術(shù)既無生物安全性問題，而且解決了因受到細(xì)胞分裂限制而一直困擾人們的原代細(xì)胞的低效率轉(zhuǎn)染，特別適用于難轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞系和原代細(xì)胞[13]。這項技術(shù)具有低毒性和高轉(zhuǎn)染效率，可以使轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞表現(xiàn)出較強的活力，外源基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。我們的前期研究將PPP2R5C小干擾RNA轉(zhuǎn)染至K562、K562R 及Jurkat細(xì)胞[7-8]，已檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率>80%，同時細(xì)胞在后續(xù)72 h保持良好的生物活性。我們在轉(zhuǎn)染效率檢測時設(shè)立轉(zhuǎn)染條件的對照組(Mock transfection)，對比轉(zhuǎn)染試劑、電流刺激對細(xì)胞的影響。

AFM把形態(tài)學(xué)與客觀數(shù)據(jù)結(jié)合，能在單細(xì)胞層面上對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行探測分析，從而可以捕捉到精準(zhǔn)的細(xì)胞本質(zhì)特征，發(fā)現(xiàn)影響因素作用后對細(xì)胞的細(xì)微改變[14]。從AFM的形態(tài)微觀結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果上看：轉(zhuǎn)染了PPP2R5C基因72 h后的細(xì)胞高度、直徑均減少，體積變小，提示這可能是PPP2R5C基因促進(jìn)CML細(xì)胞的凋亡的表現(xiàn)。在本研究中，我們每組掃描了3個細(xì)胞，結(jié)果提示各組間存在變化的趨勢，但數(shù)值上的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明PPP2R5C基因下調(diào)可能對K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)未造成明顯影響。

本研究結(jié)果顯示健康人BM-MNCs中PPP2R5C基因的表達(dá)量明顯低于K562細(xì)胞株，結(jié)合我們的前期研究結(jié)果[7,15]，即PPP2R5C基因在CML細(xì)胞中高表達(dá)、健康人外周血單個核細(xì)胞及健康人BM-MNCs中低表達(dá)的特點。因此，選擇健康人BM-MNCs作為研究對象，希望能夠了解PPP2R5C-siRNA的安全性。本研究采用PPP2R5C-siRNA 干擾組和轉(zhuǎn)染條件的MOCK對照組比較，以排除轉(zhuǎn)染條件對PPP2R5C-siRNA 作用的干擾。結(jié)果表明：PPP2R5C-siRNA對健康人BM-MNCs的體外增殖和分化無顯著影響，初步說明其安全性。我們推測PPP2R5C基因在健康人BM-MNCs中的增殖和分化中可能并未發(fā)揮明顯作用。

因此，單獨沉默PPP2R5C基因未對CML細(xì)胞株的形態(tài)產(chǎn)生明顯影響，亦未影響B(tài)M-MNCs的增殖和分化。本研究分析和證明PPP2R5C小干擾RNA的安全性問題，為CML的靶向治療提供新資料。