彭先兵， 戴潤芝

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院， 湖北 十堰 442000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常見的頭頸部惡性腫瘤，占全部頭頸部腫瘤的78%左右[1]，其發(fā)病隱匿、惡性程度較高、容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。目前，臨床上治療鼻咽癌的主要手段是采用手術(shù)聯(lián)合放化療，其中采用鉑類藥物化療是一種較為普遍的治療方案[3-5]，但是有一定比例的晚期鼻咽癌患者鉑類藥物治療效果不理想[6-7]。細胞周期蛋白依賴性激酶8(cyclin-dependent kinase 8，CDK8)基因產(chǎn)物是細胞周期蛋白依賴性激酶家族中的一員，可啟動DNA 合成、提升細胞周期時相變化及調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)錄，在細胞的增殖和分化中具有關(guān)鍵作用，其異常表達能夠加快細胞周期的運轉(zhuǎn)，其與結(jié)直腸癌、胃癌、子宮頸癌以及惡性黑色素瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后具有一定關(guān)系[8-9]。目前關(guān)于CDK8與鼻咽癌細胞的生物學(xué)行為的關(guān)系研究較少，本研究觀察CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F 細胞增殖、凋亡及順鉑敏感性的影響，為鉑類藥物有效治療鼻咽癌提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

鼻咽癌5-8F細胞株(美國ATCC公司)，CCK8(DojinDo，日本)，RPMI 1640和MTT(美國Sigma-Aldrich公司)，胎牛血清(德國PAN-Biotech公司)，兔抗人CDK8單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，兔抗人增殖細胞核抗原多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人Bcl-2、Bax、Cyclin D1、MRP1單克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人鼻咽癌5-8F細胞株用含12%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37 ℃下在5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 分組干預(yù)

培養(yǎng)細胞分為未處理組(不給予任何干預(yù))、陰性對照組(不含CDK8表達的慢病毒轉(zhuǎn)染)和轉(zhuǎn)染組(含有CDK8過表達的慢病毒)，每組12個培養(yǎng)皿。慢病毒感染靶細胞的操作流程：第1天，以合適的比例接種靶細胞于T25的培養(yǎng)瓶中(對照組和處理組)；第2天，感染前病毒原液從-80 ℃冰箱取出后冰浴融化，用含5 μg/mL Polybrene的新鮮培養(yǎng)基按合適的MOI值稀釋病毒原液，吸除對照組和處理組原有的培養(yǎng)基，含有慢病毒陰性對照稀釋液加到對照組細胞中，將含有CDK8過表達的慢病毒稀釋液加到細胞中(換液時間可根據(jù)細胞狀態(tài)可適當(dāng)延長)。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

轉(zhuǎn)染后的1 d、2 d、3 d、4 d和5 d收集人鼻咽癌5-8F細胞，制備懸液，接種于96孔板，加150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測570 nm波長吸光度，以反映細胞增殖活性。

1.5 化療藥物敏感實驗

收集對數(shù)生長期人鼻咽癌5-8F細胞采用胰酶進行消化，以5×103/孔的密度于96孔板中進行接種，每組設(shè)為6個復(fù)孔。分別添加1、2、4、8、10、20 μmol/L順鉑，培養(yǎng)48 h后于酶標(biāo)儀490 nm波長處測吸光度值。

1.6 RT-PCR檢測CDK8 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平

每名受試者均分別取適量的癌組織、癌旁組織樣本，置于凍存管中，于-80 ℃低溫冰箱總保存用于提取RNA；采用RNA提取試劑盒并嚴(yán)格按照說明書中操作步驟對樣本中總RNA進行提??；采用紫外分光光度計測定RNA濃度、純度；將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR反應(yīng)，50 uL PCR反應(yīng)體系： cDNA模板4 uL、10×PCR buffer 5 uL、正向引物2.5 uL、反向引物2.5 uL、dNTP 1 uL、Taq酶0.5 uL，25 Mm MgCl2 3.5 uL、D DH2O 31.5 uL。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，通過記錄器掃描結(jié)果，測CDK8 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。

CDK8引物: 正義鏈5′-GGGATCTCTATGTCGGCATGTAG.3′: 反義鏈5′-AAATGACGl]flrGGATGCTFAAGC.3′。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中CDK8、PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白水平

收集人鼻咽癌5-8F細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，上樣30 μg/孔，10%SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)膜，50 g/L蛋白粉封閉2 h，分別添加兔抗人CDK8單克隆抗體 (1∶10 000)、GAPDH(1∶8 000)、Cyclin D1 (1∶10 000)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶2 000)、MRP1(1∶1 000)、兔抗人PCNA多克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育，加辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(1∶2 000)，TBST漂洗， ECL顯色， Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CDK8異常表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定

鼻咽癌5-8F 細胞中CDK8 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和CDK8蛋白的表達高于未處理組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 CDK8過表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定Tab.1 Identification of CDK8 overexpressed nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

(1)與轉(zhuǎn)染組比較，P<0. 05

圖1 鼻咽癌5-8F 細胞CDK8表達(Westernblot)Fig.1 Expression of CDK8 in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

2.2 CDK8蛋白異常表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組5-8F細胞增殖速度明顯低于未處理組以及陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，未處理組與陰性對照組進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 CDK8蛋白異常表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響Tab.2 Effect of abnormal expression of CDK8 on proliforation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0.05

2.3 CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F細胞順鉑敏感性的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組5-8F細胞化療敏感率明顯高于未處理組以及陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組進行比較，差異無有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4 鼻咽癌5-8F細胞PCNA蛋白表達水平

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果圖顯示，CDK8-siRNA 轉(zhuǎn)染組PCNA 蛋白表達低于陰性對照組和未處理組(P<0.05)；CDK8-siRNA轉(zhuǎn)染組Cyclin D1 蛋白低于陰性對照組和未處理組(0.69±0.06)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖2、圖3。

表3 CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F細胞順鉑敏感性和IC50 值的影響Tab.3 Effect of abnormal expression of CDK8 on cisplatin sensitivity of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells and IC50 value

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0.05

表4 蛋白質(zhì)印跡法檢測鼻咽癌5-8F 細胞PCNA 蛋白和Cyclin D1 蛋白表達Tab.4 Expression of PCNA protein and Cyclin D1 protein in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0. 05

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉(zhuǎn)染組圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測鼻咽癌5-8F 細胞PCNA 蛋白表達水平Fig.2 PCNA protein expression in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉(zhuǎn)染組圖3 蛋白質(zhì)印跡法分別檢測鼻咽癌5-8F 細胞Cyclin D1 蛋白表達Fig.3 Cyclin D1 protein expression in nasopharyngeal carcinoma 5-8f cells

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測鼻咽癌5-8F細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達

CDK8-siRNA轉(zhuǎn)染組Bcl-2 蛋白表達比陰性對照組和未處理組低(P<0.01)。同時，Bax 蛋白表達比陰性對照組和未處理組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表5、圖4、圖5。

表5 CDK8過表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定Tab.5 The Bcl-2 and Bax protein expression of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0.05

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉(zhuǎn)染組圖4 蛋白質(zhì)印跡法分別檢測鼻咽癌5-8F 細胞Bcl-2蛋白表達Fig.4 The Bcl-2 protein expression of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉(zhuǎn)染組圖5 蛋白質(zhì)印跡法分別檢測鼻咽癌5-8F 細胞Bax蛋白表達Fig.5 The Bax protein expression of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma

3 討論

我國鼻咽癌的發(fā)病率居世界首位，且鼻咽癌具有較高的死亡率[10-11]。目前，以鉑類為基礎(chǔ)的同步化療效果較差，其中化療耐藥性是治療失敗的關(guān)鍵因素[11-12]。因此，研究化療耐藥性的分子標(biāo)志物對于緩解腫瘤細胞對化療藥物敏感性十分關(guān)鍵。CDK8 基因中包含5 個轉(zhuǎn)錄子，而僅有其中1 個轉(zhuǎn)錄子能夠編碼出現(xiàn)CDK8 蛋白[13-14]。不一樣的細胞周期蛋白依賴性激酶都包含有一段相似的結(jié)構(gòu)域，并與細胞周期蛋白結(jié)合具有密切關(guān)系[15]。另外，研究人員在細胞周期蛋白依賴性激酶分子中探索到一些關(guān)鍵位點，并針對這些位點進行磷酸化修飾，發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控細胞周期蛋白依賴性激酶的活性[16-17]。CDK8 屬于調(diào)節(jié)復(fù)合體的一員，在轉(zhuǎn)錄過程中存在關(guān)鍵意義，CDK8能夠?qū)﹃P(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性和活性產(chǎn)生直接影響，從而對細胞的轉(zhuǎn)錄進行控制。CDK8 與細胞周期蛋白C于細胞G1 /S 期協(xié)同作用，其在異常表達時導(dǎo)致細胞周期調(diào)控點失常，正常細胞逐漸進入到細胞周期，進而引發(fā)胰腺癌、胃癌以及膀胱癌的發(fā)生發(fā)展并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[18]。另外，CDK8 基因能夠和p53、早期生長反應(yīng)基因和多梳基因蛋白EZH2 協(xié)同作用，從而對細胞進行調(diào)節(jié)，CDK8表達的改變與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有直接關(guān)系，其作用機制可能與通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIH 的磷酸化存在一定的關(guān)系[19-20]。

本研究選取經(jīng)典鼻咽癌細胞系5-8F 為研究對象，通過pcDNA3.1/CDK8對鼻咽癌5-8F 細胞進行轉(zhuǎn)染，通過Realtime-PCR以及Western-blot 對CDK8異常表達進行驗證，并通過MTT以及流式細胞術(shù)研究CDK8 異常表達對5-8F 細胞增殖、凋亡的影響。結(jié)果表明，CDK8異常表達能夠下調(diào)鼻咽癌5-8F 細胞的增殖速度，故推測CDK8可提升鼻咽癌5-8F 細胞對化療藥物的敏感性。本實驗結(jié)果表明，CDK8異常表達可以提升順鉑對鼻咽癌5-8F 細胞生長的抑制活性，通過研究結(jié)果可以證實CDK8異常表達與順鉑可以協(xié)同協(xié)同抑癌活性。為了探索CDK8異常表達緩解鼻咽癌5-8F細胞順鉑耐藥的機制，我們研究了CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F 細胞相關(guān)基因表達的影響，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的代謝、凋亡和其對化療藥物的攝入或者外排功能發(fā)生紊亂是引發(fā)化療耐藥性的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明，CDK8異常表達能夠下調(diào)鼻咽癌5-8F 細胞中Cyclin D1 的表達。研究發(fā)現(xiàn)，CDK8異常表達可以上降低Bcl-2 表達，上調(diào)非小細胞肺癌細胞細胞的化療敏感性[21]。Bcl-2 是凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2過量表達可增強癌細胞的化療耐藥性[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌5-8F細胞的CDK8異常表達可下調(diào)Bcl-2 表達、上調(diào)Bax 表達和細胞凋亡率。該結(jié)果表明，順鉑能夠可以上調(diào)鼻咽癌5-8F 細胞的化療敏感性，其機制與上調(diào)Bax 表達、下調(diào)Bcl-2、MRP1、PCNA和 Cyclin D1表達有關(guān)。。

綜上所述， 鼻咽癌5-8F 細胞中CDK8的異常表達能夠抑制其增殖，上調(diào)其化療敏感性，即CDK8異常表達實鼻咽癌實施基因治療的候選靶點。