高楠楠， 侯勝開， 馬 歡， 屈 璐， 潘艷伶,2 **

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 中醫(yī)學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是2型糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)常見的臨床原因之一[1]，其特征在于進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)的進(jìn)行性積聚在DN的腎纖維化發(fā)揮關(guān)鍵作用，而轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是導(dǎo)致ECM進(jìn)行性積聚的核心因子[2]，因此TGF-β1/Smad信號通路在引起腎纖維化的研究中受到廣泛關(guān)注。目前，臨床上通過控制血糖、抗血小板凝集，抗氧化應(yīng)激等方式可以在一定程度上延緩腎損害，但不能有效逆轉(zhuǎn)疾病的病理過程[2]，因此早期診斷和預(yù)防DN成為重中之重。近年來，中醫(yī)藥憑借其毒性及副作用小等優(yōu)點(diǎn)在防治DN中受到國內(nèi)外研究學(xué)者的重視[3]，本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，糖通飲能夠下調(diào)早期DN大鼠血清中TGF-β1表達(dá)[4]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過觀察糖通飲對早期DN大鼠腎組織TGF-β1/Smad信號通路的影響，從分子生物學(xué)層面探討其作用機(jī)制，為名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方糖通飲的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要藥品、儀器及試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級雄性SD大鼠55只,體質(zhì)量(180±20)g,由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號為SCXK(黔)2002-0001]。

1.1.2主要藥品 糖通飲藥材(由生地黃、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉、牡丹皮、黃芪、丹參、地骨皮、草決明組成)由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，上述藥材用純水浸泡30 min，用專用器皿加雙蒸水進(jìn)行熬制，濃縮為含生藥1 000 g/mL的溶液，藥物冷卻后置于4 ℃冷藏保存。厄貝沙坦片(科蘇)由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ)由美國Sigma公司生產(chǎn)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(購自北京索萊寶公司)，蛋白提取試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司)，兔抗大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3(購自Abcam公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔Ig G(購自中杉金橋生物有限公司) ，ECL發(fā)光液(購自MILLIPORE公司)，動物組織總RNA提取試劑盒 [購自天根生化科技(北京)有限公司]，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自日本TAKARA公司)等。主要儀器有強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖測試儀[強(qiáng)生(中國)有限公司]，ACS-LEAS電子計(jì)重秤，BIO96孔酶標(biāo)板，TDL-5-A型臺式大容量離心機(jī)，Abi-ViiA 7 Dx 實(shí)時熒光定量PCR儀，Abi-ProFlex PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1動物模型的復(fù)制 SPF級雄性SD大鼠55只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只作為正常組(N組)，將剩余的45只給予高脂高糖飼料(43.3%基礎(chǔ)飼料+50%豬油+1.5%膽固醇+0.2%膽鹽+5%蔗糖)喂養(yǎng)6周。造模前禁食(不禁水)12 h，SD大鼠稱重后，給予1% STZ的檸檬酸緩沖液(pH 4.5)按20 mg/kg首次劑量腹腔注射，此后每隔72 h注射1次STZ(共需注射2次或3次)，且在首次劑量的基礎(chǔ)上增加5 mg/kg劑量；N組給予同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液，于每次注射72 h后尾靜脈取血測空腹血糖(FBG)，當(dāng)FBG≥16.7 mmol/L、飲水量和尿量明顯增多，則判定為2型糖尿病模型。DM模型建立后，繼續(xù)予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，3周后代謝籠收集24 h尿液，24 h尿蛋白≥30 mg[5]判定為DN模型造模成功。

1.2.2分組及治療方法 將造模成功的40只DN大鼠隨機(jī)分為模型組(M組)、糖通飲組(T組)、厄貝沙坦組(Ⅰ組)及糖通飲聯(lián)合厄貝沙坦組(T+Ⅰ)，每組10只。T組按人與動物體表面積的等效比值表折算給予糖通飲煎劑12 g/(kg·d)灌胃治療、Ⅰ組厄貝沙坦片溶于生理鹽水中按人與動物體表面積的等效比值表折算13 mg/(kg·d)給予灌胃治療、T+Ⅰ組先給予糖通飲煎劑12 g/(kg·d)灌胃，間隔6 h后再給予厄貝沙坦懸濁液13 mg/(kg·d)灌胃治療。T、Ⅰ兩組間隔6 h后再給予同等量的生理鹽水灌胃1次。N、M組均給予同等量的生理鹽水灌胃2次/d，各組均連續(xù)灌胃8周。

1.2.3標(biāo)本收集 各組大鼠治療8周末，禁食12 h后稱重，按0.3 mL/100 g體質(zhì)量給予10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，摘除大鼠的腎臟，保留腎皮質(zhì)，1×PBS沖洗多余血液，置于-80 ℃保存。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1大鼠造模前后FBG及24 h尿蛋白檢測 造模72 h后尾靜脈取血測FBG，3周后代謝籠收集24 h尿液雙辛丁酸法(BCA)檢測24 h尿蛋白。

1.3.2腎組織TGF-β1、Smad2及Smd3 mRNA表達(dá) 提取大鼠腎皮質(zhì)總RNA，并用核酸蛋白測定儀測定OD260/OD280比值(1.8～2.0)，計(jì)算RNA的濃度和純度。采用TAKARA公司PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，選擇SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)的操作，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 min(40個循環(huán))，95 ℃ 30 s，61 ℃ 15 s；上述反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因相對表達(dá)量。根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，設(shè)計(jì)的引物序列如下：GAPDH(內(nèi)參)為R(5′-3′)GGTCCAGGGTTTCTTACTCC， F(5′-3′)為GGTTGTCTCCTGCGACTTCA，TGF-β1為R(5′-3′)TACCAAGGTAACGCCAGGAA， F(5′-3′)為GCGGACTACTACGCCAAAGA， Smad2為R(5′-3′)TGAATGGCAAGATGGACGACA， F(5′-3′)為GAGCCGCCCGAAGGGTAG，Smad3為R(5′-3′)ATGGGCTCCTCATTTCACAAC， F(5′-3′)為CTGGCTCCGGTAAAGGATTG。

1.3.3腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3蛋白表達(dá) 提取大鼠腎皮質(zhì)總蛋白，BCA法測定濃度后制備成電泳樣本，10% SDS-PAGE凝膠電泳，然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；PVDF膜用5% BSA封閉2 h，1×TBST洗膜10 min(3次)，然后分別加入一抗，4 ℃過夜；1×TBST洗膜10 min(3次)，加入 HRP羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，1×TBST洗膜10 min(3次)。ECL發(fā)光液按A∶B=1∶1比例避光制備，混合后均勻滴于膜上，放入全自動熒光成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。條帶相對灰度值=目的條帶灰度值/同一樣品GAPDH灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

45只SD大鼠進(jìn)行造模，造模成功40只，死亡5只。DN大鼠治療期間由于嚴(yán)重并發(fā)癥、感染及藥物不耐受等因素影響，M組死亡3只、Ⅰ組死亡3只、T組死亡2只、T+Ⅰ組死亡4只，治療結(jié)束共計(jì)死亡12只，存活28只。

2.2 造模前后大鼠FBG及24 h尿蛋白水平

造模前各組大鼠FBG、24 h尿蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后72 h各組大鼠FBG比較，與N組比較，M組、T組、Ⅰ組及T+Ⅰ組的FBG明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模72 h時，各組大鼠24 h尿蛋白水平比較，與N組比較，M組、T組、Ⅰ組及T+Ⅰ組的尿蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組比較，T組、Ⅰ組、T+Ⅰ組的尿蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明DN大鼠造模成功。見表1。

2.3 大鼠腎組織 TGF-β1、Smad2及Smad3 mRNA表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與N組比較，M組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組比較，T組、Ⅰ組、T+Ⅰ組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T組、Ⅰ組、T+Ⅰ組組間比較，大鼠腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

表1 各組大鼠造模前后FBG、24 h尿蛋白水平Tab.1 Fasting blood glucose and 24 h urine protein levels before and after modeling in rats in each group

(1)與N組比較，P<0.05

(1)與N組比較，P<0.05；(2)與M組比較，P<0.05圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3 mRNA 的相對表達(dá)量(實(shí)時熒光定量PCR)Fig.1 Relative expression levels of TGF-β1, Smad2 and Smad3 mRNA in renal tissues of rats in each group

2.4 大鼠腎組織 TGF-β1、Smad2及Smad3 蛋白表達(dá)

Western-blot結(jié)果表明，與N組比較，M組大鼠腎組織 TGF-β1、Smad2及Smad3 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組比較，T組、Ⅰ組、T+Ⅰ組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3 蛋白均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T組、Ⅰ組、T+Ⅰ組組間比較，大鼠腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3蛋白差異均為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

3 討論

DN是糖尿病發(fā)展為ESRD的主要原因，在全世界的發(fā)病率為20%～40%[6]。因其腎小球高濾過,腎小球和腎小管基底膜增厚，ECM的進(jìn)行性積累等病理性改變，使腎臟纖維化程度逐漸加重，最終導(dǎo)致ESRD而死亡。DN的發(fā)病機(jī)理與血流動力學(xué)改變、糖脂代謝紊亂、細(xì)胞因子及異常信號通路激活等因素相關(guān)。而TGF-β1是引起腎纖維化的核心因子，Smad蛋白是其唯一的受體胞內(nèi)激酶底物，由其介導(dǎo)的TGF-β1/Smads信號通路是腎臟纖維化的核心通路[7-8]。TGF-β1被認(rèn)為是TGF-β家族中促纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子[9]。當(dāng)大量的TGF-β1釋放時，ECM同時被激活，被激活ECM在TGF-β1的強(qiáng)趨化作用下促使ECM成分沉積，使腎臟細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞肥大，引起腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等病理性改變[10-11]。Xie S等[12]的研究證實(shí)，通過下調(diào)DN大鼠TGF-β1的表達(dá)，可有效的抑制其生物學(xué)作用，從而延緩或逆轉(zhuǎn)DN的進(jìn)展。Smad蛋白是目前所知TGF-β唯一的受體胞內(nèi)激酶底物，其家族主要包括受體活化性Smad(Smad1-3、5、8)、共同偶性Smad(Smad4)、抑制性Smad(Smad6、7)3類[13]。一般認(rèn)為，在Smad蛋白介導(dǎo)的信號通路中TGF-β1先與膜上TβRⅡ結(jié)合形成復(fù)合物，然后被TβRⅠ識別形成異源三聚體，該復(fù)合物具有激酶活性，被激活的TβRⅠ激活酶使Smad2、Smad3發(fā)生磷酸化，活化的Smad2、Smad3 與Smad4形成復(fù)合物，并從胞質(zhì)異位到細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)與纖維化相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，使TGF-β1 /Smad信號通路激活并產(chǎn)生效應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠Smad2 、Smad3表達(dá)水平明顯升高，經(jīng)藥物治療后，Smad2、Smad3表達(dá)水平顯著降低，表明通過對TGF-β1 /Smad信號通路的抑制，可有效的減輕和終止DN的纖維化程度[15]。

(1)與N組比較，P<0.05；(2)與M組比較，P<0.05圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.2 The expression levels of TGF-β1, Smad2 and Smad3 proteins in renal tissues of rats in each group

本研究選方糖通飲，是全國名老中醫(yī)凌湘力教授從事臨床糖尿病治療多年所擬的經(jīng)驗(yàn)方。凌教授認(rèn)為，DN屬于消渴變證，其發(fā)病機(jī)制是以氣陰兩虛為本、瘀血阻絡(luò)為標(biāo)[16]，而瘀血貫穿DN發(fā)病的全過程[17]。因此，對DN的治療要在益氣養(yǎng)陰的基礎(chǔ)上配伍具有活血化瘀通絡(luò)之功的藥物。本方由六味地黃丸配伍黃芪、丹參、地骨皮、草決明而成。在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，六味地黃丸能夠下調(diào)TGF-β1蛋白在DN大鼠腎組織及系膜細(xì)胞中的表達(dá)，通過抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，有效的預(yù)防腎纖維化和保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞[7，18]。丹參、黃芪及其提取物均被證實(shí)能夠改善DN大鼠腎臟的纖維化程度，保護(hù)腎臟，延緩慢性腎臟疾病的進(jìn)展[19-20]。本研究結(jié)果顯示，DN大鼠腎組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加，當(dāng)對其進(jìn)行藥物治療8周未，大鼠腎組織的TGF-β1、Smad2及Smad3均有一定程度的降低。其中糖通飲組的療效與厄貝沙坦組及糖通飲+厄貝沙坦組無明顯差異，說明糖通飲單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用都具有與厄貝沙坦片相似的抑制TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)的作用。

綜上，名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方糖通飲的腎臟保護(hù)作用機(jī)制是通過抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活，從而達(dá)到延緩DN發(fā)展為終末期腎病的效果。