葉 丹， 馮紅超， 宋宇峰， 馬竹君

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2．貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院 口腔頜面外科， 貴州 貴陽(yáng) 550001； 3．貴州省食品藥品監(jiān)督管理局， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

口腔鱗狀細(xì)胞(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是人頭頸部最常見的惡性腫瘤，其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的主要原因[1]，因此針對(duì)OSCC的相關(guān)治療研究非常重要。課題組前期研究證實(shí)腫瘤組織中存在大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)，并且能極化為M1 型、M2 型[2]。在腫瘤組織及其微環(huán)境中均存在大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn), 它們與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[3]。目前大量研究提腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中TAMs的浸潤(rùn)在其中起重要作用[4]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)是STATs家族中參與多種致癌途徑的樞紐中心，持續(xù)活化的STAT3能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，在腫瘤形成過程中可通過JAK/STATs 通路不斷活化從而導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、惡化[5]。有研究顯示TAMs 可能通過誘導(dǎo) STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活STAT3 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。因此本研究以STAT3、巨噬細(xì)胞為對(duì)象，采用免疫組化法檢測(cè)二者在OSCC中的表達(dá)以及相關(guān)臨床病理特征的分析，研究癌癥中巨噬細(xì)胞的極化問題，為腫瘤治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2014-2017年貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院和貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院手術(shù)切除、術(shù)后病理確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌的患者42例。其中男 31 例、女 11例，平均60歲。所有患者均為初發(fā)腫瘤原發(fā)病損，未接受任何針對(duì)腫瘤放療、化療等治療，排除自身免疫性疾病等基礎(chǔ)相關(guān)性疾病。其中高分化23例、中低分化19 例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。另設(shè)15例腫瘤外2 cm正常黏膜組織作對(duì)照。本次研究均征得患者知情同意且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

采用非生物素二步免疫組織化學(xué)法，標(biāo)本切片后經(jīng)二甲苯, 酒精梯度脫蠟水化, 高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗鼠抗人STAT3多克隆抗體(購(gòu)自proteintech公司)，鼠抗人CD68單克隆抗體，鼠抗人 CD163 單克隆抗體4 ℃冰箱過夜，通用型二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)37 ℃烤箱孵育30 min,濃縮型DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)顯色,蘇木精復(fù)染后脫水、封片。操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以 PBS 取代一抗做陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性組織切片做陽(yáng)性對(duì)照。一抗工作濃度STAT3為1∶150、CD68為1∶40、CD163為1∶75。

1.3 結(jié)果判定

STAT3判定標(biāo)準(zhǔn)采用陽(yáng)性細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度兩項(xiàng)綜合評(píng)定陽(yáng)性結(jié)果。以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,每張切片在高倍鏡下(400倍)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，按著色強(qiáng)度評(píng)分:0分為無(wú)著色、1分為淺黃色、2分為黃色、3分為棕黃色。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分:0分為陰性、 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%記為1分、11%～50%記為2分、51%～75%記為3分、>75%記為4分。上訴兩項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總積分,>3為陽(yáng)性、≤3分為陰性。

巨噬細(xì)胞數(shù)的評(píng)定先在低倍鏡下選取5個(gè)染色較好的視野，后在高倍鏡下進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取其平均值做巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果由2位專業(yè)人員獨(dú)立閱片評(píng)估。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 STAT3、CD68+及CD163+在OSCC中的表達(dá)及浸潤(rùn)數(shù)量

STAT3陽(yáng)性表達(dá)主要定位在腫瘤細(xì)胞胞漿，染色程度呈黃色至棕褐色,而正常組織中基本不表達(dá)或僅部分弱表達(dá)，見圖1。CD68+、CD163+細(xì)胞主要位于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，分別見圖2、3，在癌周間質(zhì)呈棕黃色、黃色顆粒彌散分布，正常組織中數(shù)量較少。在癌組織STAT3表達(dá)、CD163+、CD68+細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

STAT3 CD68+ CD163+圖1 口腔鱗癌中STAT3陽(yáng)性表達(dá)、CD68+及CD163+浸潤(rùn)數(shù)量(400×)Fig.1 Positive expression of STAT3 in OSCC

組別STAT3CD163+CD68+病例組(n=42)5.19±2.9357.02±21.6244.02±23.81對(duì)照組(n=15)0.80±1.8219.40±9.52 10.07±4.10t6.7309.0828.884P<0.001<0.001<0.001

2.2 STAT3、CD68+、CD163+與OSCC各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

見表2及表3。結(jié)果顯示，STAT3、CD68+及CD163+與OSCC的臨床分期、腫瘤細(xì)胞的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表2 STAT3的表達(dá)與OSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 The relationship between the expression of STAT3 and clinical-pathologic factors in OSCC

表3 CD163+、CD68+細(xì)胞與OSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.3 The relationship between CD68+,CD163+cells and clinical-pathologic factors in OSCC

2.3 STAT3、CD68+、CD163+在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，口腔鱗癌中STAT3的表達(dá)與CD163+細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.397,P<0.05)，隨鱗癌惡性程度的增高，STAT3與CD163+的表達(dá)均明顯增高。CD163+與CD68+計(jì)數(shù)正相關(guān)(r=0.329，P=0.034)。

3 討論

近年越來(lái)越多研究方向轉(zhuǎn)向腫瘤微環(huán)境，認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體局部微環(huán)境異常相關(guān)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤所處的內(nèi)環(huán)境,腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞 (包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等) 分布于腫瘤微環(huán)境中,各個(gè)細(xì)胞又能夠表達(dá)分泌各自相關(guān)的細(xì)胞因子[7]。其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAMs) 是炎性細(xì)胞中起主要作用的一員[8]。TAMs在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中占有相當(dāng)大的比例。巨噬細(xì)胞能在腫瘤及腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞分泌的趨化因子和細(xì)胞因子的作用下被募集到腫瘤周圍，在腫瘤微環(huán)境下受細(xì)胞因子的作用下分化為不同型的TAMs。本次結(jié)果巨噬細(xì)胞在OSCC中數(shù)量明顯高于正常組(P<0.05)意味著腫瘤組織中確實(shí)存在著TAMs現(xiàn)象的聚集現(xiàn)象，提示腫瘤中存在著炎癥特別是TAMs的浸潤(rùn)，在OSCC中同樣可能起著重要的作用。

隨著研究的深入普遍認(rèn)為可以根據(jù)巨噬細(xì)胞其表型和分泌的細(xì)胞因子類型極化為與急性炎癥、T細(xì)胞免疫相關(guān)的M1型經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)的具有腫瘤免疫抑制作用的M2型選擇性活化巨噬細(xì)胞。查閱相關(guān)文獻(xiàn)顯示M2型巨噬細(xì)胞更多的參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，提高腫瘤細(xì)胞生存和遷移能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致預(yù)后不良[9]。實(shí)驗(yàn)中CD68是區(qū)別于單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的分子標(biāo)記物，用于標(biāo)記巨噬細(xì)胞但并不能區(qū)分亞型。而CD163和CD206只表達(dá)在M2型[10-11]巨噬細(xì)胞表面，目前較公認(rèn)的 M2型特異性標(biāo)記物通常采用CD163[11-12]，因此為了闡述TAMs與腫瘤間的相關(guān)關(guān)系，本次實(shí)驗(yàn)選擇以CD68蛋白標(biāo)記巨噬細(xì)胞，CD163蛋白標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD163+細(xì)胞在鱗狀細(xì)胞癌組織中浸潤(rùn)數(shù)量明顯升高，隨著腫瘤細(xì)胞及炎性因子的聚集并開始生長(zhǎng)、浸潤(rùn)時(shí)迫使巨噬細(xì)胞極性會(huì)更傾向于轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型[ 12-13]這與大多數(shù)研究一致。同時(shí)在本次實(shí)驗(yàn)中得出CD163+的浸潤(rùn)數(shù)量在淋巴結(jié)、分期、分化中差異中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示可能與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，絕大多數(shù)癌癥的致死是由于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處播散，進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤的惡性生物學(xué)行為，也因此表明巨噬細(xì)胞的極化與腫瘤分期有關(guān)。

STAT3不僅是眾多致癌途徑的中心調(diào)節(jié)樞紐，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[14]。在近幾年的研究中STAT3被認(rèn)為是M2型巨噬細(xì)胞極化的主要信號(hào)傳導(dǎo)分子之一[15]，在TAMs中起著重要作用。異常表達(dá)STAT3能上調(diào)VEGF[16]、MMPs、HIF-1α等蛋白促進(jìn)腫瘤增殖[17]，也有研究顯示STAT3缺乏會(huì)抑制血管生成[18]，表明STAT3的高表達(dá)與血管生成相關(guān)。通過新生血管生成和腫瘤基質(zhì)重塑促成腫瘤生長(zhǎng)、存活和傳播。同時(shí)有研究顯示M2型巨噬細(xì)胞通過釋放VEGF促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[19]。本研究中STAT3表達(dá)量確實(shí)在腫瘤組中明顯高于正常組織，且STAT3的陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期、分化、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與鱗癌分化程度呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí), 意味著較差的預(yù)后, STAT3表達(dá)陽(yáng)性率也呈升高趨勢(shì)，這提示STAT3可能在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起作用。而本研究利用免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明了鱗癌組織中高表達(dá)CD68+、CD163+、STAT3，在實(shí)驗(yàn)中從相關(guān)性分析得知STAT3的表達(dá)與CD163+細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.397,P<0.05)，推測(cè)STAT3的上調(diào)可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，進(jìn)一步推測(cè)二者在口腔鱗癌中可能起協(xié)同作用。

綜上所述，在OSCC中CD68+、CD163+、STAT3的浸潤(rùn)數(shù)量及表達(dá)明顯上升，提示它們的異常表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此檢測(cè)三者對(duì)于口腔癌發(fā)生發(fā)展提供一定參考。