姚芝芬， 于 明， 龔正鵬**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 耳鼻咽喉頭頸外科， 貴州 貴陽 550004)

最新數(shù)據(jù)顯示，2017年美國喉癌的新發(fā)病例約13 360例、死亡病例約3 360例[1]，2015年中國喉癌新發(fā)病例約26 400例、死亡病例約14 500例[2]。目前，分子靶向治療已經(jīng)應(yīng)用于多種癌癥，然而，對(duì)于局部晚期和轉(zhuǎn)移性喉癌而言，還需進(jìn)一步研究，建立更有效的治療靶點(diǎn)。CrkII(CT10 regulator of kinase)是一種重要的信號(hào)接頭蛋白，參與細(xì)胞各種生理和病理過程，如調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，影響癌癥的預(yù)后[3]。據(jù)報(bào)道，CrkII高表達(dá)是促進(jìn)各種人類癌癥的惡性生物學(xué)特征的原因，如肺癌[4]、成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[5]、前列腺癌[6]、胰腺癌[7]和乳腺癌[8]等。因此，本研究采用RNA干擾技術(shù)敲低Hep-2細(xì)胞中CrkII的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞惡性生物學(xué)特征的影響，探討CrkII作為喉癌治療新靶點(diǎn)的可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hep-2細(xì)胞獲贈(zèng)于重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院頭頸腫瘤課題組，CrkII RNA干擾質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒購自上海吉瑪公司。質(zhì)粒載體pGPU6/RFP/Neo，shRNA靶序列為GGATCAACAGAATCCCGATGA，陰性對(duì)照靶序列GTTCTCCGAACGTGTCACGT。RPMI-1640、0.25%胰蛋白酶及PBS購自Hyclone公司(美國)，胎牛血清及Opti-MEM購自Gibco公司(美國)，Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)，Trizol試劑(美國ambion)，SYBR Green PCR試劑盒購自KAPA Biosystems公司(美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，MTT、RIPA組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔二抗均購自Bioswamp，蛋白質(zhì)Marker(美國Thermo公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS )、TEMED及過硫酸銨購自Sigma公司(美國)，ECL發(fā)光試劑(德國Millipore)，兔抗CrkII抗體(英國Abcam公司)，兔抗GAPDH抗體(美國Cell Signaling公司)，Transwell 小室(美國 Corning公司)，熒光定量PCR 儀(Real-Time System，BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 Hep-2細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1天接種至6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)開始轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒和脂質(zhì)體分別加入150 μL無血清培養(yǎng)基中稀釋5 min，后將兩稀釋液混合以配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物(質(zhì)粒和脂質(zhì)體按照1∶2比例)，靜置20 min，隨后將復(fù)合物加入培養(yǎng)板中，使其與細(xì)胞充分反應(yīng)。轉(zhuǎn)染后4～6 h更換含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染CrkII RNA干擾質(zhì)粒)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒)和空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.2Real-time PCR 轉(zhuǎn)染48 h后，使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA的濃度和純度，根據(jù)TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，采用Real-time PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。β-actin和CrkⅡ的上下游引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃變性3 min，95 ℃ 5 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 25 s(39個(gè)循環(huán))，95 ℃ 50 s，65 ℃ 5 s?；蛳鄬?duì)表達(dá)量按2-△△Ct法計(jì)算。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for Real-time PCR

1.2.3Western blot 轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白量調(diào)整一致后取樣，沸水浴10 min使蛋白變性后離心取上清上樣，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h；加入一抗anti-CrkⅡ(1∶10 000)和anti-β-actin(1∶1 000)，4 ℃過夜；TBST 洗滌 8 min(5次)，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶500)二抗，室溫下反應(yīng)1 h，TBST洗滌 8 min(5次)，化學(xué)發(fā)光法顯影。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×104mL，接種至96孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜；每孔加MTT 20 μL(5×103mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h；吸掉上清，每孔加入 DMSO 150 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在24 h、48 h、72 h時(shí)取出1塊96孔板，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光(OD)值。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 用含有1% FBS的DMEM重懸轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞稀釋至1×108個(gè)/L，接種到transwell小室內(nèi)，每個(gè)小室加0.5 mL細(xì)胞懸液，下層的24孔板中加入0.75 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中24 h；每孔加4%甲醛溶液1 mL，室溫固定10 min；染色：吸去固定液，用PBS洗滌1次，每孔加入 0.1%結(jié)晶紫溶液1 mL，染色30 min后用PBS洗3次，晾干。用棉簽小心擦去transwell小室內(nèi)沒有遷移的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞濃度濃度為5×108個(gè)/L加入6孔板中，每孔加2 mL細(xì)胞，待細(xì)胞融合到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，第2天用槍頭垂直于6孔板底劃痕，PBS洗3次，加入無血清培養(yǎng)液，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱。分別于0 h、24 h、48 h拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CrkII基因沉默效果鑒定

圖1可見，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Hep-2細(xì)胞CrkII mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.134，P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組CrkII mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照、陰性對(duì)照明顯降低(t=19.332、11.644，P<0.01)。圖2可見，實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞CrkII蛋白的表達(dá)水平較空白對(duì)照和陰性對(duì)照明顯降低(t=24.301、18.796，P<0.01)，而陰性對(duì)照組Hep-2細(xì)胞CrkII蛋白的表達(dá)與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.527，P>0.05)，提示pGPU6/RFP/Neo-CrkII質(zhì)?？捎行б种艸ep-2細(xì)胞CrkIImRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。

(1)與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01圖1 Hep-2細(xì)胞中CrkII mRNA 表達(dá)(Real-time PCR)Fig.1 The level of CrkII mRNA in Hep-2 cells

(1)與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01圖2 Hep-2細(xì)胞中CrkII蛋白表達(dá)(Western blot) Fig.2 The expression of CrkII protein in Hep-2 cells

2.2 CrkII基因沉默對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖能力的影響

如圖3，轉(zhuǎn)染后，MTT結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)OD值均比空白對(duì)照與陰性對(duì)照組低(P<0.01)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明CrkII基因沉默后可以顯著降低Hep-2細(xì)胞的增殖。

2.3 CrkII基因沉默對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組Hep-2細(xì)胞穿過微孔膜到達(dá)下室的細(xì)胞數(shù)目分別為(155±7)個(gè)、(157±6)個(gè)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.256，P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿過微孔膜到達(dá)下室的平均細(xì)胞數(shù)目為(97±8)個(gè)，較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均明顯減少(t=10.226、9.707，P<0.01)。如圖4。

(1)與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01圖3 下調(diào)接頭蛋白CrkII對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響(MTT)Fig.3 Effect of down-regulated junction protein CrkII on the proliferation of Hep-2 cells

(1)與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01圖4 下調(diào)CrkII蛋白對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲能力的影響(Transwell,×200)Fig.4 Effect of down-regulation of CrkII protein on invasion of Hep-2 cells

2.4 CrkII基因沉默對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移能力的影響

如圖5所示，顯微鏡下(×100)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組劃痕區(qū)寬度稍有縮窄，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組劃痕區(qū)寬度明顯縮小；結(jié)果顯示，48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移距離比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.591、19.666，P<0.01)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組遷移距離比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.403，P>0.05)，提示下調(diào)CrkII表達(dá)可抑制Hep-2細(xì)胞的遷移能力。

(1)與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01圖5 下調(diào)CrkII蛋白對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移能力的影響(劃痕實(shí)驗(yàn)，×100)Fig.5 Effect of down-regulation of CrkII protein on migration of Hep-2 cells

3 討論

惡性腫瘤的特性中轉(zhuǎn)移是決定性標(biāo)志，在臨床治療過程中轉(zhuǎn)移也是主要的難點(diǎn)，腫瘤的轉(zhuǎn)移在細(xì)胞生物學(xué)行為上主要體現(xiàn)為侵襲與遷移性[9,10]。研究表明，接頭蛋白CrkⅡ在乳腺癌[11]、肺腺癌[12]、口腔鱗癌[13]等組織標(biāo)本中高表達(dá)，且與癌癥的進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)，尤其是CrkⅡ可明顯促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且，siRNA介導(dǎo)的CrkII敲除可顯著抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。因此認(rèn)為CrkII可能是治療這些惡性腫瘤的有效治療靶點(diǎn)。

CrkII作為接頭蛋白通過連接酪氨酸激酶和小G蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、粘附、增殖、分化和凋亡過程中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞骨架重構(gòu)[3,14]。CrkII通過其SH2結(jié)構(gòu)域與上游酪氨酸激酶受體或粘著斑成分如p130Cas和樁蛋白(paxillin)相連接，并通過其N端SH3結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘?hào)傳遞向下傳導(dǎo)，N端SH3結(jié)構(gòu)域可結(jié)合C3G、SOS和DOCK180將信號(hào)傳遞至小G蛋白，Sos主要參與激活Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)，而C3G和Dock180則促進(jìn)小G蛋白R(shí)ap1、R-Ras和Rac中GDP與GTP的交換[3,15]。Ras-Raf-ERK-MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、存活、遷移和血管生成[16]。p130Cas與Crk-C3G復(fù)合物結(jié)合能激活Rap1而調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附，并可以激活R-Ras，從而誘導(dǎo)JNK介導(dǎo)的細(xì)胞增殖活化，而p130Cas與Crk-DOCK180蛋白結(jié)合則誘導(dǎo)Rac1激活介導(dǎo)細(xì)胞遷移[17,18]。

為探究CrkII在喉癌中的作用，本研究采用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)喉癌Hep-2細(xì)胞中CrkII蛋白的表達(dá)，且通過Real-time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)CrkⅡ基因沉默后CrkⅡ在轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白水平的表達(dá)明顯下降。MTT結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的Hep-2細(xì)胞數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)較對(duì)照組明顯減少，提示隨著CrkII的表達(dá)下調(diào)Hep-2細(xì)胞的增殖受抑制。既往研究中，Liu等[7]人敲低CrkII的表達(dá)后胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌也展現(xiàn)出了增殖能力的減弱，此外，在體外實(shí)驗(yàn)也得出相同結(jié)論。Matsumoto[19]等人也在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，CrkII敲除后膀胱癌細(xì)胞增殖能力下降，成瘤能力受抑制。以上現(xiàn)象可推測(cè)是由于CrkII表達(dá)下調(diào)后經(jīng)其激活傳遞的增殖信號(hào)也受到影響，可檢測(cè)到Erk1/2和Akt的磷酸化水平降低，細(xì)胞周期停滯在G1期[7]。

細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)CrkII的表達(dá)后Hep-2細(xì)胞遷移能力明顯受抑制。細(xì)胞遷移的過程十分復(fù)雜，涉及肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)、細(xì)胞黏附的改變、細(xì)胞外基質(zhì)的重塑等以及在這個(gè)過程中涉及的復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)[20]。細(xì)胞遷移、侵襲并且定植于遠(yuǎn)處器官就得經(jīng)歷從原發(fā)腫瘤脫落和獲得運(yùn)動(dòng)表型。從以往的研究中可發(fā)現(xiàn)，整合素信號(hào)經(jīng)p130Cas-Crk-Dock180復(fù)合物傳遞后可使Rac1大量激活，從而刺激細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)，使偽足延伸，并促進(jìn)粘著斑形成，最終引起細(xì)胞的遷移[21]。CrkII表達(dá)下調(diào)后影響整合素信號(hào)傳遞，由此可見，Hep-2細(xì)胞遷移能力與CrkII的表達(dá)水平有關(guān)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)CrkII的表達(dá)后，Hep-2細(xì)胞的侵襲能力與遷移能力一致收到影響，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞侵襲能力明顯下降。既往研究中也發(fā)現(xiàn)CrkII表達(dá)受抑制后細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱。Dhupkar等[6]人在前列腺癌細(xì)胞株中敲除CrkII，結(jié)果顯示CrkII被敲除后前列腺癌的遷移與侵襲能力減弱。另外，Ryuji等[19]人膀胱癌中也發(fā)現(xiàn)CrkII表達(dá)下調(diào)后膀胱癌的遷移與侵襲能力明顯受影響。細(xì)胞內(nèi)CrkII的表達(dá)下調(diào)后出現(xiàn)細(xì)胞遷移、侵襲能力下降，可能是由于CrkII的表達(dá)下調(diào)影響整合素信號(hào)傳遞。此外，在肺癌中曾發(fā)現(xiàn)Crk和TGF-β可以構(gòu)成一個(gè)正反饋回路促進(jìn)上皮-間質(zhì)充轉(zhuǎn)化(EMT)[4]。在膀胱癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，HGF/c-Met/Crk反饋回路可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而刺激膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲[19]。因此，也不排除CrkII表達(dá)下調(diào)影響腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。

綜上所述，CrkⅡ蛋白在喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲中起重要作用，RNA干擾下調(diào)CrkⅡ在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)后可明顯抑制細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征，CrkⅡ作為惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)還須進(jìn)一步深入的研究，希望可以為喉癌的治療提供新的選擇。