陳 麗， 楊 玨， 邱劍飛， 苑春茂， 吳昌學， 李艷梅**， 郝小江**

(1.貴州中醫(yī)藥大學， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省中科院天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014； 3.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽 550025)

白血病是造血系統常見的惡性腫瘤，是嚴重危害人類健康的惡性疾病之一，化療是治療白血病的主要手段。傳統的化療藥物在殺傷白血病細胞的同時，對人體正常細胞也產生較強的毒副作用，容易導致化療失敗[1-3]。急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia,AML)是一組造血干或祖細胞異常的克隆性惡性疾病，其典型特征為白血病克隆細胞成熟分化障礙而停滯在細胞發(fā)育階段，且伴隨凋亡抵抗和惡性增殖[4]。長期以來，AML細胞對化療藥物的凋亡抵抗是導致化療失敗和疾病復發(fā)的根源[5]。新的藥物和化療方案在一定程度上改善了這種局面，因而急性早幼粒細胞白血病有望獲得治愈。然而，大多數急性髓系白血病亞型的治療，在目前仍然困難重重[6]。已報道AML的發(fā)生與染色體易位、基因突變等多種因素有關，其致病機制尚未完全闡明[7]。HEL(human erythroleukemia)細胞是1982年從紅白血病患者的外周血中分離的紅白血病細胞，經證實含有JAK2V617F突變。HEL細胞在受到不同誘導因素的刺激時，有向紅系、單核巨噬系或巨核系多向分化的潛能，因此具有很重要的研究價值[8]。本研究采用不同濃度本課題組前期分離和鑒定的化合物Isogarcinol處理白血病細胞系HEL細胞[9]，探討 Isogarcinol對白血病細胞的凋亡和增殖的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Isogarcinol是本課題組前期分離和鑒定的化合物[9]，結構式如圖1。溶解于DMSO(二甲基亞砜)，儲存濃度為20 mmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆?。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國HyClone公司。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，HiFiScript cDNA合成試劑盒和UltraSYBR混合物購自cwbiotech(中國北京)。引物由Invitrogen(中國上海)制備，PARP、Cleaved PARP、ERK 1/2和p-ERK 1/2等抗體均購自美國CST公司。流式細胞儀為美國BD公司產品，實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

圖1 Isogarcinol的化學結構Fig.1 Chemical structure of Isogarcinol

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HEL細胞來自加拿大多倫多大學，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2MTT法檢測化合物IC50值 取對數期細胞，離心，用10 %胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基重懸，按每孔8 000個細胞數接種于96孔板中，按濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25 μmol/L加入Isogarcinol化合物，DMSO為空白對照，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每個濃度設置4個復孔。用顯微鏡采集圖片，離心，去除細胞培養(yǎng)液，加入10 μL含10% MTT的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心去除上清液，每孔加入160 μL的DMSO，室溫震蕩15 min，在490 nm光激發(fā)下用酶標儀測吸光度(OD)值。

1.2.3細胞生長曲線測定 取對數期生長細胞，離心，用10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基重懸，按每孔8 000個細胞數接種于96孔板中。待細胞穩(wěn)定，加入濃度梯度為15、10、5 μmol/L的Isogarcinol化合物，DMSO為空白對照。采用細胞計數板計數12、24、36、48、72 h的細胞數，并繪制細胞生長曲線。每個實驗重復3次。

1.2.4流式細胞術分析細胞凋亡 利用Annexin V/PI雙染法通過流式細胞術檢測HEL凋亡的情況。用DMSO作對照，加入濃度梯度為15、10、5 μmol/L的化合物Isogarcinol處理12、24、48 h，計數每106個細胞用100 μL 1×binding buffer重懸，每100 μL 1×binding buffer各加入5 μL的Annexin V和PI染液，室溫避光孵育15 min，離心去除染液，用200 μL 1×binding buffer重懸，通過流式細胞分析儀上機檢測。

1.2.5RNA提取和實時定量RT-PCR(qRT-PCR) 將對數生長期HEL細胞以3×108/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別加入Isogarcinol終濃度為5、10、15 μmol/L，對照組加入等量的DMSO。24 h后用Trizol試劑提取總RNA，將各孔裂解液吸到EP管中，加入氯仿，用力振搖。室溫下孵育2～3 min，離心后，轉移上層無色液體至新EP管中。加入異丙醇0.5 mL，混勻。20 ℃下孵育10 min，離心棄上清，沉淀加入75%乙醇1 mL，用槍吹打均勻，離心后加入DEPC水溶解。用 cDNA反轉錄試劑盒合成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ苑崔D錄cDNA為模板，β-actin為內參，熒光實時定量RT-PCR擴增c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8基因，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primers were used in this study

1.2.6Western blot實驗 將對數生長期的HEL細胞以3×108/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別加入Isogarcinol終濃度為5、10、15 μmol/L，對照組加入等量的DMSO。24 h后離心收集細胞沉淀，加入預冷的裂解液，冰上裂解細胞30 min，于4 ℃ 12 000 r/min，離心12 min。取上清，即得到細胞總蛋白質。用BCA試劑盒測定蛋白質濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃熱變性10 min。按相等上樣量進行SDS-PAGE，隨后在冰浴條件下進行濕轉。轉移完成后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗PARP、cleaved PARP、ERK 1/2、p-ERK 1/2、Bax、Bad、p -Stat3、stat3、c-Myc、cleaved caspase-3、Capase-3、cleaved caspase8、Capase-8、Bcl-2、JAK2和β-actin孵育，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，加辣根過氧化物酶標記二抗室溫作用2 h，TBST洗膜3次，然后用LI-COR進行掃膜。

1.2.7小鼠體內實驗 4～5周齡的SCID小鼠購自北京華盛康盛科技有限公司，動物雌雄各半。隨機分為生理鹽水組(Blank)、DMSO對照組、給藥組按小鼠體質量5、2.5 mg/kg Isogarcinol，腹腔注射給藥，每兩天注射1次，共注射7次，統計小鼠的存活時間和體質量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Isogarcinol對人紅白血病細胞系HEL活性及增殖能力影響

如圖2，通過MTT細胞活力測定Isogarcinol對HEL的活性，結果顯示，Isogarcinol對HEL細胞具有殺傷作用，在Isogarcinol濃度達到10 μmol/L時，抑制率達到85%，進一步計算得出其IC50值為5.4 μmol/L。同時通過顯微鏡觀察發(fā)現Isogarcinol對HEL的細胞形態(tài)有影響；提示Isogarcinol能抑制HEL的細胞活性，同時用Isogarcinol(0～15 μmol/L)處理細胞12、24、36、48、72 h后，采用細胞計數法繪制細胞生長曲線，顯示出Isogarcinol顯著抑制HEL細胞的增殖。

2.2 Isogarcinol誘導人紅白血病細胞系HEL凋亡

采用流式細胞儀分析了Isogarcinol處理后HEL細胞的凋亡，結果顯示，不同濃度Isogarcinol處理后，HEL細胞中凋亡細胞群中存在顯著的劑量和時間依賴性(圖3)。在Isogarcinol>10 μmol/L時，細胞凋亡率與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05或<0.01)。

2.3 Isogarcinol在RNA水平上調控凋亡相關基因的表達

qRT-PCR結果顯示，Isogarcinol處理HEL細胞后，促凋亡基因Bax的表達增加，Caspase-3、Caspase-8的表達下調，抗凋亡基因Bcl-2、c-Myc的表達下調(圖4)。

注：A和B示Isogarcinol對人紅白血病細胞系HEL細胞活力和形態(tài)變化的影響，C示Isogarcinol抑制HEL增殖圖2 Isogarcinol對人紅白血病細胞系HEL細胞活性及增殖的影響Fig.2 The effect of Isogarcinol on viability of HEL cells

與對照組同時點比較，(1)P<0. 05，(2)P<0.01圖3 Isogarcinol誘導人紅白血病細胞系HEL細胞凋亡Fig.3 Isogarcinol induced HEL cell apoptosis

與對照組比較，(1)P<0.05圖4 Isogarcinol調控人紅白血病細胞HEL中相關凋亡基因的表達(qRT-PCR)Fig.4 Effect of Isogarcinol on the mRNA expression levels of apoptosis-related genes

2.4 Isogarcinol通過調節(jié)JAK2/Stat3以及凋亡蛋白的表達，誘導人紅白血病細胞HEL的凋亡

為了闡明Isogarcinol誘導HEL細胞凋亡可能的機制，本研究通過Western blot檢測了Isogarcinol處理后HEL細胞裂解液中JAK2/Stat3及相關凋亡蛋白的表達。結果顯示,與對照組比較，Isogarcinol各濃度組Bad、Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase8和cleaved PARP的相對表達量呈濃度依賴性上調，而Bcl-2、caspase3、caspase8、PARP、p-Erk及c-Myc的相對表達量呈濃度依賴性下調(圖5)。提示Isogarcinol能夠下調JAK2及p-Stat3 蛋白水平的表達，可能Isogarcinol通過調節(jié)JAK2/ Stat3信號通路進而影響下游相關凋亡蛋白表達，從而誘導HEL細胞發(fā)生凋亡。

圖5 Isogarcinol通過調控JAK2/Stat3途徑中關鍵蛋白以及凋亡蛋白表達而誘導細胞凋亡Fig.5 The effect of Isogarcinol on the expression levels of part of genes in JAK2/Stat3 pathway and apoptosis-related genes

2.5 Isogarcinol延長白血病小鼠存活時間，提高血紅細胞比容

體內實驗結果表明，與對照組相比，Isogarcinol顯著延長了小鼠的存活時間，并且增加了血紅細胞比(圖6)，表明Isogarcinol能夠在體內抑制白血病的發(fā)生及發(fā)展。

與對照組比較，(1)P<0.05圖6 Isogarcinol延長白血病小鼠存活時間并提高血紅細胞比容Fig.6 Isogarcinol prolonged the survival of HEL tumor-bearing mice and increased hematocrit

3 討論

目前白血病的治療手段主要有化療、放療、造血干細胞移植、生物靶向治療、細胞免疫治療等。然而，目前的治療手段仍遠遠不能滿足臨床需求，白血病的治療難度依舊很大，由此帶來的家庭及社會負擔依舊很重。因此，迫切需要尋找新的治療方法和藥物[10-17]。AML 是一種造血干細胞的惡性克隆性疾病。AML 可由髓系細胞分化發(fā)育過程中造血干細胞或造血祖細胞惡性轉化而來，也可繼發(fā)于化療、放療或由其他疾病如骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)、骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasm,MPN)演變而來，繼發(fā)性AML 在分子遺傳特性上與原發(fā)性AML 不同且臨床預后較差[18]。在AML中有很大一部分病例發(fā)生基因突變從而導致了相應信號轉導通路的異常，在原發(fā)性AML 中，FLT3、NPM1、DNMT3α等是常見的突變[19]， 而在繼發(fā)于MPNs 的AML中，JAK2、TENT、IDH1/2、ASXL1 等突變常見，JAK2-STAT 信號通路異?；罨贏ML 發(fā)生中有重要作用[20]。

JAK是一類非受體酪氨酸激酶，它可以通過細胞因子或生長因子與相應受體結合而被激活。JAK家族有包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。JAK與細胞因子之間不存在個體對應，這表明JAKs各家族成員可以通過一種細胞因子被激活，并且?guī)追N不同的細胞因子也可以激活同一JAK[21]。STATs是一類可以與脫氧核糖核酸(DNA)結合的特殊蛋白家族。STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6。JAK被誘導磷酸化后，活化STAT以形成二聚體，使STAT以二聚體形式進入細胞核并調節(jié)靶基因的表達[22]。JAK-STAT信號通路參與多種生理調節(jié)過程，涉及細胞的生長、分化，造血以及免疫功能等[23]。近年來，在血液系統腫瘤中研究發(fā)現，JAK-STAT通路在白血病、淋巴瘤及骨髓增殖性腫瘤的發(fā)病中具有重要作用[24]。Seido Oku通過干擾RNA阻斷JAK2-STAT5通路發(fā)現，存在JAK2V617的MPN細胞增殖明顯受到抑制，認為JAK2V617F可磷酸化下游STAT3通路[25]。

本實驗通過研究Isogarcinol對HEL細胞增殖及凋亡的影響，結果顯示：Isogarcinol作用于HEL細胞后，與DMSO對照組相比，顯著抑制HEL細胞的增殖。流式細胞術結果顯示，Isogarcinol處理HEL細胞12、24、48 h后，隨著Isogarcinol濃度的增加和作用時間的延長，Isogarcinol組HEL細胞出現明顯凋亡。實時熒光定量PCR結果顯示，促凋亡基因Bax明顯上調，而Bcl2、caspase3、caspase8、PARP及c-Myc顯著下調。蛋白質免疫印跡結果顯示，Isogarcinol作用于HEL細胞24 h，發(fā)現JAK2、p-Stat3、Bcl2、caspase3、caspase8、PARP、p-Erk和c-Myc相對表達量呈濃度依賴性的下調。Bad、Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase8及cleaved PARP的相對表達量呈濃度依賴性的上調。動物體內實驗結果表明，Isogarcinol小鼠組與DMSO對照組比，顯著延長了小鼠的存活時間，并且增加了血紅細胞比，表明Isogarcinol能夠在體內抑制白血病的發(fā)生及發(fā)展。以上實驗結果表明：Isogarcinol可顯著抑制HEL細胞增殖，誘導細胞凋亡，可以得出結論：Isogarcinol可以通過抑制JAK2/Stat3信號通路，導致參與細胞凋亡的基因出現明顯變化，并且誘導細胞凋亡。