陳 珺， 劉舒媛， 聶 磊， 朱永玉， 李傳印， 劉楠楠， 周紫云， 史 荔， 張淑瓊**

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650118; 2.昆明市第三人民醫(yī)院， 云南 昆明 650041)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，屬黃病毒科的單股正鏈RNA病毒。據(jù)WHO《2017年全球肝炎報(bào)道》顯示，2015年全世界有7 100萬人存在慢性HCV感染，我國感染率為0.7%，感染者高達(dá)987.5萬人[1]。HCV感染后，20%的急性感染者可自發(fā)清除，其余發(fā)展為慢性持續(xù)感染，在30年內(nèi)，慢性持續(xù)感染者有20%～30%發(fā)展為肝硬化，每年有1%～2%的肝硬化患者發(fā)展成肝癌[2-3]。目前，盡管直接抗病毒(direct-acting antiviral agents，DAA)小分子藥物能夠治愈HCV感染，但近年來新發(fā)HCV感染病例仍在增加[4]。HCV感染初期及持續(xù)的CD4+T和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)對于控制HCV感染十分關(guān)鍵，與急性HCV感染患者相比，慢性HCV感染者體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度顯著降低[5]。HCV屬于高變異病毒，感染后易產(chǎn)生抗原漂變而逃避宿主的免疫識(shí)別[6]。已清除病毒的患者體內(nèi)有針對各種表位的全面的T細(xì)胞反應(yīng)，而HCV慢性感染者體內(nèi)僅有少量的HCV特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，提示HCV感染的臨床結(jié)局與宿主免疫系統(tǒng)的有效應(yīng)答有關(guān)[7-9]。CCR5(C-C chemokine receptoer type5)是趨化因子CC亞家族受體成員，是人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)進(jìn)入CD4+T細(xì)胞的主要輔助受體[10]。CCR5主要表達(dá)于NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞表面，在抗病毒的免疫應(yīng)答中，參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和遷移，CCR5的表達(dá)變化可影響病毒的感染進(jìn)程[11-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV) 慢性感染者的CCR5表達(dá)水平下調(diào)[15]。CCR5基因從啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)會(huì)影響CCR5的轉(zhuǎn)錄和mRNA穩(wěn)定性，從而影響CCR5的表達(dá)，最終影響機(jī)體的免疫應(yīng)答[10]，但目前未見CCR5啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)與HCV慢性感染相關(guān)性的研究報(bào)道。本文通過檢測CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域6個(gè)SNPs位點(diǎn)，分析這6個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率及所構(gòu)建單倍型頻率與HCV慢性感染的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

根據(jù)知情同意原則，隨機(jī)選取356例在云南省某醫(yī)院就診的HCV慢性感染者作為病例組，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)2015年制定的《丙型肝炎防治指南》[16]診治標(biāo)準(zhǔn)，臨床和實(shí)驗(yàn)學(xué)檢查明確患者血清抗-HCV陽性，HCV RNA≥15 000 U/L持續(xù)6個(gè)月以上，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和(或)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)升高、肝臟病理學(xué)符合慢性肝炎表現(xiàn)，且患者未經(jīng)抗病毒、保肝等治療；排除合并慢性HBV等其他病毒性肝炎、非酒精性、脂肪性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎、失代償性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、遺傳代謝性肝病及肝臟血管病等其他肝病患者。隨機(jī)選取353例同期正常健康體檢者(血清抗HCV、HCV-RNA陰性，且血清ALT、AST水平正常)作為對照組。所有受試者均為居住于云南地區(qū)的彼此無血緣關(guān)系漢族個(gè)體，其中病例組男200例、女156例，對照組男180例、女173例。

1.2 方法

1.2.1樣本DNA提取 采集受試者空腹靜脈血5 mL、EDTA抗凝，置-80 ℃保存、備用。按照Qiagen血基因組DNA提取試劑盒說明書提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2.2CCR5基因啟動(dòng)子SNPs檢測 使用以下引物對CCR5啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，CCR5 上游引物序列為5′-GACGAGAAAGCTGAGGGTAAGA-3′，下游引物序列為5′-TAACCGTCTGAAACTCATTCCA-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1 388 bp。擴(kuò)增體系包括：模板DNA 10 ng，上下游引物各10 pmol，TaKaRa PCR Mix 25 μL(含ExTaq聚合酶，dNTPs)，ddH2O 21 μL，反應(yīng)總體系50 μL。PCR條件為98 ℃預(yù)變性10 min，98 ℃變性10 s、55 ℃退火5 s、72 ℃延伸90 s(共30個(gè)循環(huán))。PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序以檢測該區(qū)域中的多態(tài)性基因座。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

病例組和對照組受試者的年齡、性別比、肝功能指標(biāo)等各項(xiàng)基本信息比較采用t檢驗(yàn)，群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。病例組和對照組間各SNPs的基因型、等位基因頻率差異用卡方檢驗(yàn)(χ2)，使用SHEsis[17]計(jì)算各SNPs位點(diǎn)間的連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)，根據(jù)LD結(jié)果構(gòu)建單倍型，兩位點(diǎn)間的LD關(guān)系用D′表示，D′>0. 8認(rèn)為位點(diǎn)間強(qiáng)連鎖，病例組和對照組間單倍型的頻率分布差異用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用SNPStats在線軟件對CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行遺傳模式分析[18]，用于分析的遺傳模式包括共顯性遺傳模式(codominant model)、顯性遺傳模式(dominant model)、隱性遺傳模式(recessive model)、超顯性遺傳模式(overdominant model)及加性遺傳模式(log-additivemodel)；并根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則(akaikein formation criterion，AIC)和貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesian information criterions，BIC)的數(shù)值來確定每個(gè)位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式，即AIC和BIC數(shù)值最小的遺傳模式。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SNPstats軟件進(jìn)行，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 年齡、性別及血清ALT、AST水平

病例組和對照組的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；病例組血清ALT、AST水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且病例組患者血清ALT、AST水平符合HCV慢性感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 兩組被檢者年齡、性別及血清ALT及AST水平Tab.1 Basic characteristics of the subjects

2.2 測序發(fā)現(xiàn)的CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域9個(gè)SNPs位點(diǎn)

測序結(jié)果與GenBank(NC_000003.12)序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域有9個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為rs2227010、rs2856758、rs2734648、rs1799987、rs1799988、rs41469351、rs1800023、rs41355345及rs1800024；其中，6個(gè)SNPs位點(diǎn)rs2227010、rs2734648、rs1799987、rs1799988、rs1800023及rs1800024在云南省漢族人群中具有多態(tài)性。

2.3 等位基因與基因型分析

CCR5基因啟動(dòng)子具有多態(tài)性的rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023(G>A)及rs180024 (C>T) SNPs位點(diǎn)在病例組和對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0. 05)。比較兩組6個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布的結(jié)果顯示，rs2227010的A等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.753，95%CI為0.578～0.983，P=0.026)，但經(jīng)FDR校正后，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其余5個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率與基因型頻率分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4 6個(gè)SNPs位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析

CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域6個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，rs2227010(A>G)，rs2734648(T>G)， rs1799987 (G>A)，rs1799988 (T>C)， rs1800023(G>A)，rs180024 (C>T)位點(diǎn)之間存在強(qiáng)連鎖不平衡(D’>0.8)，見表3。

2.5 單倍型分析

構(gòu)建CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域6個(gè)SNPs位點(diǎn)rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、 rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023(G>A)及rs180024 (C>T)的單倍型，選取單倍型頻率>3%的單倍型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，共有3種單倍型的頻率>3%，單倍型在病例組和對照組的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)，見表4。

表2 兩組被檢者CCR5基因啟動(dòng)子6個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布Tab.2 The distribution frequencies of alleles and genotypes of at 6 SNPs locus in case group and control group

表3 CCR5基因啟動(dòng)子6個(gè)SNPs位點(diǎn)的的連鎖不平衡分析Tab.3 Linkage disequilibrium analysis on 6 SNPs in CCR gene promoter

2.6 遺傳模式分析

分別用共顯性遺傳模式、顯性遺傳模式、隱性遺傳模式、超顯性遺傳模式及加性遺傳模式對各SNPs位點(diǎn)與HCV慢性感染的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，SNPs位點(diǎn)rs2227010在病例組與對照組之間比較，最優(yōu)的遺傳模式為顯性遺傳模式(P=0.034)和加性遺傳模式(P=0.032)，但經(jīng)FDR校正后，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余5個(gè)SNPs位點(diǎn)rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023(G>A)及rs1800024 (C>T)基因型在病例組和對照組中的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

表4 病例組和對照組CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域6個(gè)SNPs位點(diǎn)單倍型頻率比較Tab.4 Comparison of haplotype frequency of 6 SNPs in CCR5 gene promoter region between case group and control group

表5 6個(gè)SNPs位點(diǎn)在病例組和對照組中的遺傳模式分析Tab.5 Analysis of genetic patterns of 6 SNPs sites in case group and control

續(xù)表5

SNPs位點(diǎn)遺傳模式基因型病例組(n,%)對照組(n,%)OR(95% CI)P校正PAICBICrs1800023共顯性G/G101(28.6)103(28.9)10.75>0.05988.31 002.0 A/G183(51.8)176(49.4)0.94(0.67～1.33) A/A69(19.6)77(21.6)1.09(0.72～1.67) 顯性G/G101(28.6)103(28.9)10.92>0.05986.9996.0 A/G-A/A252(71.4)253(71.1)0.98(0.71～1.36) 隱性G/G-A/G284(80.5)279(78.4)10.49>0.05986.4995.5 A/A69(19.6)77(21.6)1.14(0.79～1.64) 超顯性G/G-A/A170(48.2)180(50.6)10.52>0.05986.5995.6 A/G183(51.8)176(49.4)0.91(0.68～1.22) 加性---------1.04(0.84～1.28)0.74>0.05986.8995.9rs1800024共顯性C/C200(56.7)214(60.1)10.42>0.05987.11 001.0 C/T136(38.5)121(34.0)0.83(0.61～1.14) T/T17(4.8)21(5.9)1.15(0.59～2.25) 顯性C/C200(56.7)214(60.1)10.35>0.05986.0995.1 C/T-T/T153(43.3)142(39.9)0.87(0.64～1.17) 隱性C/C-C/T336(95.2)335(94.1)10.52>0.05986.5995.6 T/T17(4.8)21(5.9)1.24(0.64～2.39) 超顯性C/C-T/T217(61.5)235(66.0)10.21>0.05985.3994.4 C/T136(38.5)121(34.0)0.82(0.60～1.12) 加性---------0.94(0.73～1.20)0.60>0.05986.6995.7

注：加性“---”表示多態(tài)性位點(diǎn)如為A>G的變異，則加性遺傳模式表示2GG+AG基因型與AA基因型進(jìn)行比較

3 討論

CCR5基因位于人染色體3p21.31，由1個(gè)啟動(dòng)子、4個(gè)外顯子和2個(gè)中間分隔的內(nèi)含子組成。CCR5屬于G-蛋白耦聯(lián)受體超家族成員，是β趨化因子RANTES、MIP-1α、MIP-1β的細(xì)胞受體，CCR5主要表達(dá)于NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞表面，在抗病毒的免疫應(yīng)答中，參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和遷移[11-14]。CCR5的表達(dá)變化可影響病毒的感染進(jìn)程。Gilliam等[15]研究表明，下調(diào)CCR5的表達(dá)，可減緩HIV的感染進(jìn)程，Vilela等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CCR5表達(dá)缺失的小鼠，可加速HSV(herpessimplex virus，HSV)的清除。Javad等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HBV慢性感染者的CCR5表達(dá)水平下調(diào)。CCR5基因從啟動(dòng)子區(qū)到編碼區(qū)有很多多態(tài)性位點(diǎn)[21]，這些多態(tài)性位點(diǎn)可能影響CCR5的轉(zhuǎn)錄和mRNA穩(wěn)定性，從而影響CCR5的表達(dá)，最終影響機(jī)體的免疫應(yīng)答[10]。CCR5啟動(dòng)子多態(tài)性與許多病毒的感染相關(guān)：rs1799987G基因及rs1799988T基因與HBV感染急性期的病毒清除有關(guān)[22]；rs1799987A/G基因變體可減少CCR5的轉(zhuǎn)錄，從而減緩HIV的感染進(jìn)程[23]，此外，Shien等[24]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶rs1799987A/A基因突變的個(gè)體，CD4+細(xì)胞表面的CCR5水平升高，從而加速了HIV的感染進(jìn)程。Konishi[25]等研究發(fā)現(xiàn)，rs1799987G/G基因與HCV慢性感染者的干擾素治療效果相關(guān)，CCR5啟動(dòng)子區(qū)域基因多態(tài)性位點(diǎn)的存在可以影響CCR5的表達(dá)水平，最終影響病毒的感染進(jìn)程[25-26]。目前，未見CCR5啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)與HCV慢性感染相關(guān)性研究報(bào)道。CCR5基因有2個(gè)啟動(dòng)子，位于第1內(nèi)含子上游的弱啟動(dòng)子(Upstream promoter,PU)，和位于第1內(nèi)含子包括第2外顯子，及3外顯子的部分的強(qiáng)啟動(dòng)子(Downstream promoter,PD)[27]。CCR5啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)，可通過以下2種方式影響CCR5的表達(dá):(1)5’UTR的多態(tài)性位點(diǎn)影響啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的種類，數(shù)量及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的穩(wěn)定性，從而影響CCR5基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響CCR5的表達(dá)水平，rs2734468T基因具有更強(qiáng)的核因子(Nuclear factor,NF)結(jié)合活性；(2)5’UTR多態(tài)性位點(diǎn)的存在，使得5’UTR區(qū)域形成不同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而影響CCR5 mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯，影響CCR5的表達(dá)水平[10]。本研究的6個(gè)SNPs位點(diǎn)均位于強(qiáng)啟動(dòng)子PD，因而其多態(tài)性可能會(huì)影響CCR5基因的轉(zhuǎn)錄，繼而影響CCR5的表達(dá)。rs1799987與HBV感染急性階段的清除[21]、HIV-1的感染進(jìn)程[28]及干擾素治療HCV的療效[24]有關(guān)，而本研究結(jié)果顯示，rs1799987與HCV的慢性感染無關(guān)。rs1799988C可降低兒童患HIV的風(fēng)險(xiǎn)[29]，rs1800023G基因可降低兒童和成人感染HIV的風(fēng)險(xiǎn)[30]，rs1800024T基因與中國南方漢族HIV-1的感染相關(guān)[31]，本研究中，對這些位點(diǎn)與云南漢族人群HCV慢性感染的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示這些位點(diǎn)可能與云南漢族人群HCV慢性感染無關(guān)。

CCR5強(qiáng)啟動(dòng)子PD區(qū)域的SNPs位點(diǎn)之間存在強(qiáng)連鎖，不同的CCR5轉(zhuǎn)錄活性影響了CD4+T細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，HHC單倍群的個(gè)體具有更多的CD4+T細(xì)胞，從而減緩HIV的感染進(jìn)程[32-33]。本研究中，所有個(gè)體的rs2856758(A>G)和rs41469351(C>T)沒有多態(tài)性，rs2856758位點(diǎn)均為A，rs41469351均為C，而這兩個(gè)位點(diǎn)突變對應(yīng)的單倍群分別為HHG和HHD，因此在云南漢族人群中，未發(fā)現(xiàn)HHG及HHD單倍群。本研究構(gòu)建了CCR5啟動(dòng)子區(qū)域6個(gè)SNPs位點(diǎn)的單倍型，分析結(jié)果顯示所構(gòu)建的單倍型均與云南漢族人群HCV慢性感染無關(guān)，在云南漢族人群中，分布頻率最高的單倍型為ATGTGC(47.97%)，AGACAT(19.04%)，GGACAC(15.31%)這一結(jié)果與中國南方漢族人群中的單倍型結(jié)果一致[31]，其中ATGTGC屬于HHC單倍群，AGACAT屬于HHF單倍群，GGACAC屬于HHE單倍群。

由于SNP位點(diǎn)的頻率分布在不同人群中存在差異性，另外，HCV慢性感染的免疫機(jī)制與HIV不同，CCR5是HIV-1早期感染人體的主要輔助性受體，而在HCV的感染進(jìn)程中，CCR5主要通過影響細(xì)胞免疫來調(diào)解抗病毒應(yīng)答[34]，因此CCR5與病原體感染的相關(guān)性并不相同。對于對研究云南漢族人群CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性與HCV慢性感染的關(guān)系存在一定的局限性，需要在以后的研究中擴(kuò)大樣本量，并增加其他多態(tài)位點(diǎn)的檢測，以期發(fā)現(xiàn)與云南漢族人群HCV慢性感染相關(guān)的SNP位點(diǎn)。