孔 靜， 田平平， 孟慶敏， 盧雨微， 張國忠， 肖 瑛， 郭 兵， 石明雋**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴陽市第四人民醫(yī)院, 貴州 貴陽 550000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，是引起終末期腎病的主要原因之一，其發(fā)病機制尚不清楚。腎小管間質(zhì)纖維化是DN進(jìn)展為終末期腎病的重要病理基礎(chǔ)，腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1-2]，Wnt信號通路是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的一條關(guān)鍵信號通路[3-5]，SFRP1是該通路的抑制因子[6]。阿托伐他汀是一種經(jīng)典的降脂藥，有減少尿蛋白排泄、減輕細(xì)胞外基質(zhì)聚集等腎臟保護作用[7]，前期研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可抑制單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)大鼠腎纖維化時腎組織Wnt4/β-catenin信號通路活化，改善腎纖維化病變，但具體機制尚不清楚[8]。本研究以DN小鼠為研究對象，觀察阿托伐他汀對小鼠腎組織Wnt4/β-catenin信號通路及SFRP1表達(dá)的影響及延緩DN腎纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京碧云天生物研究所)，SP試劑盒、DAB顯示試劑(北京中杉金橋公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas)，SuperReal PreMix Plus(北京天根公司)。小鼠抗大鼠β-actin(武漢普美生物)，兔抗小鼠SFRP1、Wnt4、β-catenin、E-cadherin、col-Ⅳ(北京博奧森)，α-SMA(美國santa 公司)，山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗(武漢普美生物)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理 雄性清潔級昆明小鼠30只，體質(zhì)量(30±10)g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物批號SCXK(黔)2012-0001。30只小鼠隨機分為正常對照(NC)組、糖尿病腎病(DN)組及阿托伐他汀治療(Ato)組，每組10只。DN和Ato組小鼠禁食不禁水3 h，給予55 mg/kg STZ腹腔注射、連續(xù)5 d、1次/d，NC組給予相同劑量無菌檸檬酸鈉緩沖液處理。造模第1周開始，小鼠禁食不禁水3 h后采集各組小鼠尾靜脈檢測空腹血糖，以造模第2周血糖≥16.7 mol/L判定為造模成功。造模第5周開始，Ato組小鼠給予阿托伐他汀(用0.5%羧甲基纖維素配制成混懸液)20 mg/(kg·d)灌胃4周， NC組和DN組小鼠給予等體積0.5%羧甲基纖維素。

1.2.2標(biāo)本收集 造模第9周時禁食不禁水3 h，乙醚麻醉后處死各組小鼠，摘除眼球取血，離心取血清-20 ℃保存；解剖分離腎臟，部分腎臟固定于4%中性甲醛液中供石蠟切片用，其余腎臟-80 ℃保存供后期實驗用。于處死小鼠前1天用代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量，離心取上清-20 ℃保存。

1.2.3生化指標(biāo)檢測 小鼠血、尿標(biāo)本送貴陽金域公司檢測血糖、膽固醇、尿素氮、甘油三酯、肌酐及24 h尿蛋白。

1.2.4腎組織形態(tài)學(xué)觀察 用4%中性甲醛固定的腎臟組織制作成厚度約為3 μm石蠟切片，行HE和Masson染色，光鏡觀察腎組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5免疫組化染色觀察 β-catenin和SFRP1表達(dá) 制備好的3 μm石蠟切片按照兩步法檢測試劑盒進(jìn)行免疫組化染色，烤片、脫蠟、PBS漂洗、3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、微波抗原修復(fù)、PBS漂洗、一抗孵育(SFRP1 1∶100，β-catenin 1∶100)過夜，次日取出切片，PBS漂洗、二抗孵育、DAB顯色、流水沖洗、胞核復(fù)染、上行脫水、中性樹膠封片后鏡下觀察及采集圖像。

1.2.6Western blot檢測小鼠腎組織SFRP1、β-catenin、E-cadherin 1、α-SMA 1及Col-IV蛋白表達(dá) 冰上提取小鼠腎組織總蛋白、BCA法蛋白定量后取50 μg/孔上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗孵育過夜(β-actin 1∶4 000、SFRP1 1∶400、β-catenin 1∶300、E-cadherin 1∶400、α-SMA 1∶400、Col-IV 1∶1 000)，次日TBST洗膜后二抗孵育1 h，TBST洗膜3×10 min，ECL發(fā)光， Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶，Image Lab軟件分析條帶灰度值，用目的蛋白條帶灰度值比上內(nèi)參β-actin條帶的灰度值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7Real time-PCR檢測小鼠腎組織SFRP1 mRNA表達(dá) Trizol法提取總RNA，IMPLEN核酸蛋白儀檢測RNA濃度和純度，按照Fermentas試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Real- time PCR反應(yīng)根據(jù)SuperReal PreMix Plus試劑盒設(shè)定反應(yīng)體系，Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，以β-actin為內(nèi)參照，目的基因的相對含量以2-ΔΔCt表示。PCR反應(yīng)引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況和相關(guān)生化指標(biāo)

造模第1周，小鼠血糖逐漸升高，部分小鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第2周時，全部模型組小鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第9周時，與NC組比較，DN組小鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、尿量增多、消瘦及體重減輕。NC組小鼠毛發(fā)光亮，飲食飲水正常，體質(zhì)量持續(xù)增加，經(jīng)Ato治療后上述癥狀有所減輕；與NC組比較，DN組小鼠的血糖、尿素、肌酐、24 尿蛋白、甘油三酯及膽固醇均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 與DN組比較，Ato組小鼠尿素、肌酐、24 h尿蛋白、甘油三酯和膽固醇較DN組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠部分血液生化指標(biāo)比較Tab.1 Mouse blood biochemical indexes

(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05

2.2 腎組織形態(tài)學(xué)

HE染色可見NC組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整，腎小管排列緊密、整齊，腎間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤；DN組小鼠腎小球體積增大，腎小管管腔明顯擴張，間質(zhì)見炎性細(xì)胞浸潤；Ato組間質(zhì)炎性浸潤細(xì)胞明顯減少。Masson染色NC組小鼠腎組織未見膠原纖維沉積，DN組小鼠則顯示腎小管間質(zhì)有大量藍(lán)色條索狀物質(zhì)沉積，Ato治療組上述病變明顯較DN組小鼠輕(圖1)。

圖1 各組小鼠腎組織HE、Masson染色(200×)Fig.1 HE staining and Masson staining of the kidney tissue in each group mice

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

NC組可見腎組織幾乎未見β-catenin蛋白表達(dá)，SFRP1在腎小管上皮細(xì)胞胞漿中有較多棕黃色陽性表達(dá)。N組可觀察到β-catenin在腎小管上皮細(xì)胞胞漿和胞膜陽性表達(dá)增多且在核中表達(dá)，SFRP1在腎小管上皮細(xì)胞胞漿中棕黃色陽性表達(dá)較少；與DN組比較，Ato組β-catenin陽性表達(dá)減少，而SFRP1陽性表達(dá)增加(圖2)。

圖2 β-catenin和SFRP1蛋白在各組小鼠腎組織中的表達(dá)(免疫組化，×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of kidney β-catenin and SFRP1

2.4 Western blot結(jié)果

與NC組比較，DN組小鼠腎皮質(zhì)Wnt4、β-catenin、α-SMA和Col-IV蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.05)，SFRP1和E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。給予阿托伐他汀治療后，Wnt4、β-catenin、α-SMA和Col-IV蛋白表達(dá)較DN組明顯減少，而SFRP1和E-cadherin蛋白表達(dá)則有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

(1)與NC組比較,P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05圖3 SFRP1、Wnt4、β-catenin、E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白在各組小鼠腎組織中的表達(dá)(Western blot)Fig.3 The effect of atorvastatin on expression levels of SFRP1, Wnt4, β-catenin, E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅳ

2.5 Real-Time PCR結(jié)果

與NC組相比，DN組小鼠腎皮質(zhì)中SFRP1 mRNA表達(dá)明顯降低，Ato組SFRP1 mRNA表達(dá)較DN組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但仍低于NC組(圖4)。

(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05圖4 各組小鼠腎組織中SFRP1 mRNA表達(dá)(Real-time PCR)Fig.4 The effect of atorvastatin on SFPR1 mRNA levels in mouse renal cortex

3 討論

阿托伐他汀是常用的降脂藥，同時還具有抗炎、抗氧化等作用。王湘研、陳雪芬等[9-12]研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以改善心肌纖維化和肺纖維化。阿托伐他汀同樣也具有抗腎纖維化效應(yīng)[13-14]，本課題組的前期研究表明阿托伐他汀可抑制UUO大鼠腎組織Wnt/β-catenin信號途徑的活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)，使腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)沉積減少，腎纖維化病變得到改善，但具體機制尚不明確。

本研究采用55mg/kg STZ多次腹腔注射成功復(fù)制I型糖尿病小鼠模型，生化及HE和Masson染色結(jié)果提示DN組及Ato組小鼠出現(xiàn)腎臟損害，繼發(fā)DN，而Ato組小鼠經(jīng)過阿托伐他汀治療后，小鼠一般情況改善，尿素氮、24尿蛋白、甘油三酯、總膽固醇、肌酐均明顯降低，病理形態(tài)觀察可見間質(zhì)炎性浸潤細(xì)胞明顯減少，PAS染色陽性物質(zhì)減少，纖維化病變減輕，說明阿托伐他汀對DN小鼠腎具有一定的保護作用。β-catenin是經(jīng)典Wnt通路的核心分子，其在胞漿中積聚增多后轉(zhuǎn)移入核是經(jīng)典Wnt信號通路活化的標(biāo)志[15-16]。本實驗免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示DN組小鼠腎組織β-catenin表達(dá)較NC組明顯增高，進(jìn)一步證實了經(jīng)典Wnt信號通路活化參與了DN腎纖維化發(fā)生，給予阿托伐他汀治療后Ato組β-catenin表達(dá)較DN組明顯減少，說明阿托伐他汀可抑制DN小鼠腎組織經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的活化。SFRPs是Wnt信號通路的拮抗因子，其家族成員包括SFRP1-5，其中SFRP1高表達(dá)于腎臟[17-20]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)DN小鼠腎組織SFRP1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于NC組小鼠，提示DN發(fā)生時Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路的活化可能與該通路抑制因子SFRP1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而對該通路抑制作用減弱有關(guān)。經(jīng)阿托伐他汀治療后，與DN組相比Ato組小鼠腎組織SFRP1 mRNA和蛋白表達(dá)增多，Wnt4、β-catenin、α-SMA和collagen-IV蛋白表達(dá)下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，提示阿托伐他汀可能是通過上調(diào)SFRP1的表達(dá)而增強了對Wnt4/β-catenin信號通路的抑制作用，故阿托伐他汀干預(yù)后Wnt4/β-catenin信號通路相關(guān)分子表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)而使其下游信號分子間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和collagen-IV表達(dá)減少，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)上調(diào)，延緩DN小鼠EMT的發(fā)生和減少ECM沉積，起到了延緩DN小鼠腎纖維化的作用。與段興旺等[21]在大鼠UUO腎纖維化模型中發(fā)現(xiàn)益腎康膠囊可能通過上調(diào)SFRP1表達(dá)而下調(diào)了β-catenin蛋白的表達(dá)，從而延緩腎纖維化進(jìn)程的實驗結(jié)果一致。

綜上所述，在DN小鼠腎纖維化進(jìn)程中，SFRP1 mRNA和蛋白水平的下調(diào)可能是導(dǎo)致wnt4/β-catenin信號通路異常活化的原因，而阿托伐他汀可以通過上調(diào)DN小鼠腎組織SFRP1 mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制wnt4/β-catenin信號通路活化，延緩DN小鼠腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。