羅彥波，龐永強(qiáng)，姜興益，付亞寧，張洪非，李翔宇，朱風(fēng)鵬，陳 歡

國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

卷煙的圓周會(huì)影響抽吸過程中煙氣的形成和遞送［1-2］。有研究表明，卷煙主流煙氣焦油、煙堿和一氧化碳釋放量隨著圓周的減小而線性降低［3-4］。近年來細(xì)支卷煙（煙支直徑為17.0±1.0 mm）等小圓周卷煙的產(chǎn)銷量持續(xù)上升。與常規(guī)卷煙相比，小圓周卷煙具有焦油和有害成分釋放量低、直徑小、長(zhǎng)度大和吸阻高等特點(diǎn)［5-6］。隨著全球控?zé)熉募s工作的深入開展，細(xì)支卷煙已受到廣泛的關(guān)注［7］。因此，研究不同圓周卷煙的主流煙氣釋放物及煙氣毒理學(xué)特征對(duì)細(xì)支卷煙產(chǎn)品設(shè)計(jì)和質(zhì)量監(jiān)控具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)在細(xì)支卷煙的制造工藝及品質(zhì)穩(wěn)定性方面已有較多的研究報(bào)道［8-11］。甘學(xué)文等［12］研究了加拿大深度抽吸（HCI）模式下細(xì)支卷煙煙氣常規(guī)指標(biāo)的釋放特點(diǎn)；田忠等［9］研究了制絲關(guān)鍵工序?qū)?xì)支卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)、有害成分及致香成分的影響；葛暢等［6］比較了細(xì)支卷煙與常規(guī)卷煙煙氣指標(biāo)的釋放量差異；邊照陽等［5］考察了市售細(xì)支卷煙的主流煙氣有害成分釋放量情況。有關(guān)細(xì)支卷煙煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)方面的研究報(bào)道較少，Coggins等［13］研究了煙支圓周對(duì)煙氣體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果的影響，但該研究中使用的細(xì)支卷煙不含濾嘴，與當(dāng)前市售產(chǎn)品差異較大。另外，研究卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的逐口釋放量有助于了解卷煙的燃吸過程及焦油、煙堿的遞送規(guī)律，可為卷煙產(chǎn)品設(shè)計(jì)及質(zhì)量控制提供參考［14］。為此，制作3種葉組配方相同的細(xì)支、中支和常規(guī)卷煙，分析ISO和HCI抽吸模式下的卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)和有害成分（以煙氣危害性評(píng)價(jià)指數(shù)H表示），評(píng)價(jià)卷煙煙氣體外毒理學(xué)特征，并考察卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的逐口釋放規(guī)律，旨在了解不同圓周卷煙主流煙氣成分的釋放特征和毒理學(xué)差異，為適應(yīng)WHO對(duì)細(xì)支卷煙的管控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

由相同烤煙型葉絲制作的不同圓周（24、20和17 mm）卷煙（福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司廈門卷煙廠提供）；中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫）；鼠傷寒沙門氏菌TA98（中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供）；大鼠S9活化系統(tǒng)（美國(guó)Moltox公司）。

煙堿（≥98.5%，國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心）；一氧化碳標(biāo)準(zhǔn)氣體（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)氣體研究中心）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）；氰化氫溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（58 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；銨離子溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg/mL，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK，≥97%，加拿大Toronto公司）；液氮、氦氣、氮?dú)夂蜌鍤猓?9.999%，河南科益氣體股份有限公司）；乙腈、甲醇和環(huán)己烷（色譜純，德國(guó)Merck公司）；巴豆醛、苯酚和苯并［a］芘（B［a］P，≥99%），醋酸、乙酸銨和二甲亞砜（色譜純），十二烷基硫酸鈉（99%），環(huán)磷酰胺（97%），2-氨基芴（98%）（美國(guó)Sigma公司）。

CP224S電子天平（感量0.000 1 g，德國(guó)Sartorius公司）；SM450型20通道吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean公司）；RM200A和RM20H轉(zhuǎn)盤型吸煙機(jī)， 92和 44 mm劍橋?yàn)V片（德國(guó)Borgwaldt-KC公司）；Agilent 7890A氣相色譜儀（配火焰離子化檢測(cè)器）、Agilent 1200高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）、Agilent7890-5975氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀（德國(guó)Bran+Luebbe公司）；IC3000離子色譜儀（美國(guó)Dionex公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；J-II全自動(dòng)定量濃縮儀（北京普立泰科儀器有限公司）；Q-POD Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；96孔板（美國(guó)Corning公司）；底層培養(yǎng)基（1.8%瓊脂粉、2.0%葡萄糖和2.0%磷酸鹽溶液）、頂層培養(yǎng)基（0.6%瓊脂粉、0.5%NaCl溶液和0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液）（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；0.45 μm水相和有機(jī)相濾頭（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 卷煙物理指標(biāo)的測(cè)定

按照 GB/T 5606.1—2004［15］進(jìn)行取樣并隨機(jī)分組，每組30支。將卷煙樣品按照GB/T 16447—2004［16］的方法于溫度（22±1）℃和相對(duì)濕度（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h。依據(jù)GB/T 22838.2—2009［17］、GB/T 22838.3—2009［18］、GB/T 22838.4—2009［19］和 GB/T 22838.15—2009［20］的方法分別測(cè)試長(zhǎng)度、圓周、質(zhì)量和通風(fēng)率。

1.2.2 卷煙主流煙氣化學(xué)指標(biāo)的分析

（1）煙氣化學(xué)指標(biāo)釋放量及H指數(shù)分析。按照 GB/T 16447—2004［16］的方法將卷煙樣品于溫度（22±1）℃和相對(duì)濕度（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h［16］。依據(jù) GB/T 19609—2004［21］、GB/T 23355—2009［22］、GB/T 23356—2009［23］、YC/T 253—2008［24］、YC/T 377—2010［25］、YC/T 254—2008［26］、YC/T 255—2008［27］、GB/T 21130—2007［28］和 YQ/T 17—2012［29］的方法分別分析ISO和HCI抽吸模式下主流煙氣中總粒相物（TPM）和焦油、煙堿、CO、HCN、NH3、巴豆醛、苯酚、B［a］P和 NNK 的釋放量。由上述指標(biāo)計(jì)算卷煙主流煙氣H指數(shù)［30］。

（2）煙氣常規(guī)指標(biāo)逐口釋放量分析。用RM20H轉(zhuǎn)盤型吸煙機(jī)在ISO抽吸模式下抽吸卷煙。每輪抽吸20支卷煙，將每輪同一口序的煙氣TPM捕集在同一張劍橋?yàn)V片上，分析后得到不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的逐口釋放量。

1.2.3 卷煙主流煙氣毒理學(xué)指標(biāo)的評(píng)價(jià)

女孩的身體還非常虛弱，但她仍然幫著青辰將天葬師背回了屋中。天葬師昏迷著，心口的刀傷已經(jīng)不再有鮮血流出，好似他的整個(gè)身體的血液，都已經(jīng)干涸。

分別在ISO和HCI抽吸模式下抽吸卷煙，用92 mm劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣TPM，并用二甲亞砜萃取TPM，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的主流煙氣TPM萃取溶液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，將其稀釋到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度。依據(jù)YQ/T 42—2013［31］、YQ 4—2011［32］和 YQ 3—2011［33］的方法分別評(píng)價(jià)卷煙煙氣的細(xì)胞毒性、體外微核率和致突變性。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，通過單因素方差分析和多重比較、配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)不同樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)，并判定P＜0.05時(shí)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 卷煙常規(guī)物理指標(biāo)分析結(jié)果

3種卷煙樣品的物理指標(biāo)如表1所示。由表1可以看出，中支卷煙和細(xì)支卷煙的長(zhǎng)度大于常規(guī)卷煙；吸阻和總通風(fēng)率均隨卷煙圓周的增大而降低；中支卷煙和細(xì)支卷煙的濾嘴通風(fēng)率相當(dāng)，且都顯著高于常規(guī)卷煙；煙絲質(zhì)量則隨著卷煙圓周的增大而增加。

表1 3種卷煙樣品物理指標(biāo)Tab.1 Physical indexes of 3 cigarette samples

2.2 卷煙主流煙氣化學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果

3種卷煙樣品在ISO和HCI抽吸模式下的煙堿及7種有害成分釋放量如表2所示。由表2可以看出，隨著卷煙圓周的減小，卷煙主流煙氣化學(xué)指標(biāo)的釋放量逐漸降低，這主要是由煙絲量減少所致。為了客觀地比較不同圓周卷煙主流煙氣化學(xué)指標(biāo)的釋放量，本研究中采用WHO推薦的單位煙堿釋放量（mg/mg煙堿）方式［34］進(jìn)一步比較了圓周對(duì)卷煙主流煙氣常規(guī)煙氣指標(biāo)及H指數(shù)的影響。

3種卷煙樣品的煙堿釋放量、常規(guī)煙氣指標(biāo)單位煙堿釋放量及H指數(shù)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，在ISO抽吸模式下，3種卷煙樣品之間存在顯著性差異（P＜0.05）。在HCI抽吸模式下，常規(guī)卷煙與中支和細(xì)支卷煙之間存在顯著性差異（P＜0.05）；細(xì)支卷煙與中支卷煙僅煙堿釋放量和單位煙堿H指數(shù)之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

表3 2種抽吸模式下3種卷煙樣品的單因素方差分析和多重比較結(jié)果①Tab.3 Results of single-factor analysis of variance and multiple comparisons of 3 cigarette samples under two smoking regimes

圖1 ISO抽吸模式下3種卷煙常規(guī)煙氣指標(biāo)和有害成分（以H指數(shù)表示）的單位煙堿釋放量Fig.1 Routine smoke indexes and 7 harmful components（expressed as H index）per unit nicotine yield of 3 cigarette samples under ISO smoking regime

圖2 為HCI抽吸模式下3種卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的單位煙堿釋放量及H指數(shù)。可見，卷煙主流煙氣7種有害成分（以H指數(shù)表示）的單位煙堿釋放量隨著圓周的減小呈降低趨勢(shì)；而TPM、水分和焦油的單位煙堿釋放量均呈現(xiàn)中支卷煙>細(xì)支卷煙>常規(guī)卷煙的趨勢(shì)。這可能是由于細(xì)支卷煙參與燃燒的煙絲量明顯少于中支和常規(guī)卷煙（經(jīng)計(jì)算，3種卷煙參與燃燒的煙絲體積比為細(xì)支卷煙∶中支卷煙∶常規(guī)卷煙=1.00∶1.38∶1.48），且中支卷煙的煙堿釋放量低于常規(guī)卷煙。通過比較2種抽吸模式下的釋放量，發(fā)現(xiàn)HCI抽吸模式下主流煙氣水分的單位煙堿釋放量顯著高于ISO抽吸模式。

圖2 HCI抽吸模式下3種卷煙常規(guī)煙氣指標(biāo)和有害成分（以H指數(shù)表示）的單位煙堿釋放量Fig.2 Routine smoke indexes and 7 harmful components（expressed as H index） per unit nicotine yield of 3 cigarette samples under HCI smoking regime

2.3 卷煙主流煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果

基于單位TPM計(jì)算的卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果如表4所示?？梢钥闯?，在ISO抽吸模式下，體外細(xì)胞毒性呈現(xiàn)常規(guī)卷煙>細(xì)支卷煙≈中支卷煙的趨勢(shì)；在HCI抽吸模式下，體外細(xì)胞毒性呈現(xiàn)中支卷煙≈常規(guī)卷煙>細(xì)支卷煙的趨勢(shì)。說明在2種抽吸模式下，卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性整體上隨著煙支圓周的減小而下降。對(duì)于相同圓周卷煙，HCI抽吸模式下的IC50值均略高于ISO抽吸模式，這與文獻(xiàn)［13，35］報(bào)道的結(jié)果一致。

2.3.2 體外微核試驗(yàn)結(jié)果

基于單位TPM計(jì)算的卷煙煙氣體外微核測(cè)試結(jié)果如表5所示?？梢钥闯?，與空白對(duì)照相比，所有樣品的微核率均顯著增加，并呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明所有卷煙主流煙氣TPM均存在一定的遺傳毒性。

2.3.3 致突變性試驗(yàn)結(jié)果

基于單位TPM計(jì)算的卷煙煙氣Ames試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。可以看出，在較高的TPM濃度下，3種卷煙主流煙氣均使TA98的回復(fù)突變菌落比值（回復(fù)突變菌落數(shù)/自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)，MR）≥2，且呈劑量依賴關(guān)系，說明所有受試煙氣TPM均具有一定致突變性。

表4 3種卷煙主流煙氣TPM的細(xì)胞抑制率和IC50值Tab.4 Cell inhibition rate and IC50value for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples （%）

表5 3種卷煙主流煙氣TPM的體外微核測(cè)試結(jié)果Tab.5 Results of in vitro micronucleus assay for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples （%）

表63 種卷煙主流煙氣TPM的Ames試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of Ames test for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples

對(duì)2種抽吸模式下不同圓周卷煙主流煙氣的毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果如表7所示?？梢钥闯觯琁SO抽吸模式下，常規(guī)卷煙與中支和細(xì)支卷煙煙氣細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)的P值均小于0.05，說明具有顯著性差異，常規(guī)卷煙的細(xì)胞毒性最高。HCI抽吸模式下，中支卷煙與細(xì)支卷煙煙氣細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)的P值小于0.05，說明具有顯著性差異，且中支卷煙煙氣的細(xì)胞毒性高于細(xì)支卷煙。不同圓周卷煙主流煙氣的體外微核率和致突變性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的P值均大于0.05，說明無顯著性差異。

表7 2種抽吸模式下3種卷煙樣品的毒理學(xué)數(shù)據(jù)配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果①Tab.7 Paired-t test results of in vitro toxicology data of 3 cigarette samples under two smoking regimes

2.4 常規(guī)煙氣指標(biāo)的逐口釋放量變化

ISO抽吸模式下不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的逐口釋放量如圖3所示?？梢钥闯?，細(xì)支卷煙的抽吸口數(shù)較少。卷煙抽吸過程中，第1口（點(diǎn)燃抽吸）和最后1口（終止抽吸）的煙氣釋放量與其他口之間存在較大差異。第1口的差異主要來源于卷煙點(diǎn)燃過程，最后1口的差異主要是因?yàn)槌槲煌耆?6］。不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的逐口釋放量基本上呈現(xiàn)隨抽吸口數(shù)的增加而增加的趨勢(shì)，這可能是由于卷煙燃燒使煙支長(zhǎng)度不斷減小，導(dǎo)致未燃燒煙絲和濾嘴的過濾效果變差。

圖3 3種卷煙樣品常規(guī)煙氣指標(biāo)的逐口釋放量Fig.3 Puff-by-puff releases of routine smoke indexes of 3 cigarette samples

3 結(jié)論

①ISO抽吸模式下，中支卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的單位煙堿釋放量和H指數(shù)最低；HCI抽吸模式下，不同圓周卷煙主流煙氣單位煙堿H指數(shù)隨著圓周的降低而下降。②卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性整體上隨著煙支圓周的減小而下降，不同圓周卷煙煙氣TPM的遺傳毒性和致突變性無顯著性差異。③不同圓周卷煙主流煙氣常規(guī)指標(biāo)的逐口釋放量整體上呈現(xiàn)隨抽吸口數(shù)增加而增加的趨勢(shì)。