于海寧，黃海勇，何成自菁，素維查，沈生榮*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州310032；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

鄰苯二甲酸酯常被用作塑料添加劑，增加聚氯乙烯塑料制品的透明度、耐久性和壽命，被用于食品包裝材料、醫(yī)療器械、玩具等中。鄰苯二甲酸二異辛酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]和鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate,DBP）是使用最廣泛的塑化劑。根據(jù)動物模型的毒理學(xué)結(jié)果，塑化劑具有致癌[1-3]、造成激素失調(diào)和生殖障礙等毒性[4-6]。當(dāng)前，塑化劑容易被濫用，用于代替?zhèn)鹘y(tǒng)昂貴的乳化劑（如棕櫚油）而被添加到食品中。因此，建立快速有效的塑化劑選擇性識別和吸附方法具有重要的實際意義。

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer,MIPs）能選擇性吸附目標分子，可進行化學(xué)分離和分析，已被廣泛應(yīng)用于傳感器、對映體分離、生物醫(yī)學(xué)和分析應(yīng)用等方面[7]，具有高穩(wěn)定性、耐久性、可靠性及生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點。參與MIPs形成的主要成分是模板分子、功能單體和交聯(lián)劑。在過去的研究中，有研究者將β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin,β-CD）及其衍生物選為單功能單體[8-10]或雙功能單體之一[11]。其中，雙功能單體合成的MIPs對目標分析物具有更好的特異性吸附效果[12]。

本文以DEHP為模板，以烯丙基-β-環(huán)糊精（allyl-β-cyclodextrin,allyl-β-CD）為單功能單體，或分別將allyl-β-CD與甲基丙烯酸（methacrylic acid,MAA）、甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate,MMA）、丙烯腈（acrylonitrile,AN）、丙烯酰胺（acrylamide,AA）結(jié)合作為雙功能單體，以二甲基丙烯酸乙二醇酯（ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA）作為交聯(lián)劑，制備出一系列DEHP印跡聚合物，并用于奶粉中DEHP含量測定（DEHP及其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示），通過分子印跡固相萃取-高效液相色譜法（molecular imprinting solid-phase extraction-high performance liquid chromatography,MISPE-HPLC）測定其回收率，旨在對所制備的MIPs的選擇性結(jié)合能力進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

鄰苯二甲酸二異辛酯（DEHP,99%）、鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate,DINP,99%）、鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate,DMP,99%）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate,DEP）、β-環(huán)糊精（β-CD,96%）、烯丙基溴（98%）、甲基丙烯酸（MAA,99%）、甲基丙烯酸甲酯（MMA,99%）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA,98%）、偶氮二異丁腈（azodiisobutyronitrile,AIBN,99%）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF,99.5%）和異丙醇（isopropanol,IPA,99.5%），均為分析純，購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

丙烯腈（AN，99%）、丙烯酰胺（AA，99%）和色譜純甲醇，分別購自Gracia化學(xué)科技（成都）有限公司、合肥Biosharp有限公司和天津Sayfo科技有限公司。用于分子印跡聚合物合成和高效液相色譜流動相的超純水，由實驗室水凈化系統(tǒng)（上海華膜實業(yè)有限公司）制得。

β-CD和AIBN試劑分別用水和甲醇重結(jié)晶。重蒸餾的MAA、MMA、AN功能單體和已制備好的DEHP原液（1 mmol/mL，溶于色譜純甲醇中）在MIP本體聚合前存儲于4℃冰箱中，備用。

圖1 DEHP及其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of DEHP and its analogues

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1200 HPLC系統(tǒng)：配有紫外可見可變波長檢測器（225 nm）、G1312B雙泵、G1322A脫氣器、SL型自動進樣器，溫控室；采用C18反相色譜柱（250 mm×4.60 mm×5μm）；流動相中V（甲醇）∶V（異丙醇）∶V（水）=250∶100∶50；流速1 mL/min，控制溫度30℃，注入體積10μL，運行時間6 min。

1.3 allyl-β-CD的制備

烯丙基溴和β-CD的反應(yīng)如下：將20 g氫氧化鈉（NaOH）溶于20 mL水中，不斷攪拌直到完全溶解；加入20 g β-CD，在60℃水浴鍋中攪拌2 h；加入4 mmol烯丙基溴，通氮氣，連續(xù)攪拌2 h，內(nèi)部溫度為60℃；將溶液水浴30 min，再置于60℃烘箱中干燥3 d，獲得干燥的反應(yīng)混合物。用研缽和研杵粉碎并研磨成細粉，用無水乙醇洗5次，每次5 min，以減少產(chǎn)品的殘留物。

1.4 MIPs的制備

將2.8 g allyl-β-CD溶解在40 mL DMF中，30 min后添加2 mmol DEHP，通氮氣，60℃下磁攪拌2 h；分別加入12 mmol功能單體（MAA、MMA、AN、AA），反應(yīng)1 h；加入60 mmol EGDMA反應(yīng)1 h，再加入40 mg AIBN作為引發(fā)劑；約30 min后生成固態(tài)反應(yīng)混合物，60℃水浴孵化24 h；取出固體，放入烘箱中干燥2 d。將干燥后的樣品粉碎并研磨成粉末，過400目篩；收集微粒，用熱水清洗，再用V（甲醇）∶V（乙酸）=9∶1進行索氏提取，直到用紫外可見分光光度儀檢測不到DEHP；最后用甲醇洗凈MIPs，去掉殘留乙酸。M-MAA制備示意圖見圖2。非印跡聚合物（non-imprinted polymers,NIPs）除了不添加模板，制備條件與MIPs相同。

1.5 溶劑對吸附的影響試驗

將不同體積比的甲醇和水（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）作為MIPs和NIPs吸附測試的溶劑，先混合甲醇與DEHP，渦旋混勻，再加入水。與其他研究多使用MAA作為功能單體制備MIPs[13-16]不同，本試驗選用MAA-allyl-β-CD雙功能單體分子印跡聚合物（M-MAA）為模型，評估其在不同溶劑中吸附DEHP的強度。

將20 mg聚合物懸浮在3 mLDEHP（1 mmol/L）溶液中，于10 mL錐形瓶里以130 r/min振蕩，控制溫度為30℃。分別懸浮1、3、6、9、12 h后，用0.22μm過濾器過濾，取1 mL過濾液用于高效液相色譜分析。聚合物吸附物質(zhì)比例的計算公式如下：

吸附百分比=[（初始值-吸附后的游離值）/初始值]×100%。

1.6 特異性吸附試驗

圖2 M-MAA制備示意圖Fig.2 Schematic representation for preparation of DEHP-imprinted polymer made of MAA-linked allyl-β-CD(M-MAA)

檢測所有合成的MIPs和NIPs在溶劑中對目標分子的吸附能力，達到吸附平衡時，聚合物對模板分子的吸附量（Q，μmol/g）計算公式[13]如下：

式中：V為溶液體積，mL；Ci為初始濃度，μmol/mL；Ca為吸附后的游離濃度，μmol/mL；m為聚合物的干燥質(zhì)量，g。

DEHP的分布系數(shù)（Kd）方程[17]為，用于分析其在聚合物和溶液之間的親合力。

特異性吸附能力公式為ΔQ/（μmol/g）＝Q（MIPs）-Q（NIPs），用于計算MIPs和NIPs吸附值的差異。

分子印跡因子（IF）的計算公式為IF=K（dMIP）/K（dNIP），用于驗證印跡結(jié)果。

1.7 動力學(xué)吸附和競爭性吸附試驗

為研究聚合物對不同濃度（0.10～1.00 mmol/L）模板分子的吸附效果，將20 mg聚合物懸浮在3 mL DEHP溶液中，于10 mL錐形瓶里以130 r/min振蕩，溫度30℃。將DEHP的一系列結(jié)構(gòu)類似物（包括DMP、DEP和DINP）在相同條件下進行測試，以確定聚合物的競爭吸附能力和效率，以及對結(jié)構(gòu)相關(guān)成分的功能性識別，溶液濃度均為1 mmol/L。

1.8 基于分子印跡固相萃取的印跡效果驗證試驗

1.8.1 結(jié)合吸附

將50 mg聚合物放入移液管，塞上棉花，再在頂部放一層石英晶體砂。在加載樣品前，用3 mL甲醇和3 mL水對聚合物進行預(yù)處理。制備濃度為0.1 mmol/L DEHP的甲醇標準溶液。將1和3μmol DEHP分別裝入微型柱中，然后添加1 mL甲醇、1mL水。每個樣品中加入4 mL吸附溶劑。用6 mL含10%甲醇的水淋洗，以除去所有DEHP溶液中未被吸附的成分。再用5 mL體積比為9∶1的甲醇-乙酸溶液洗脫，移除模板分子。不斷地將洗脫液收集到試管中，用氮氣吹干，然后用1 mL甲醇重新溶解，進行高效液相色譜分析。洗脫溶劑通過柱子的流速為0.5 mL/min。

1.8.2 競爭性吸附

DEHP及其結(jié)構(gòu)類似物（DMP、DEP和DINP）被混合于甲醇溶液中，最終濃度為40μmol/mL。按照1.8.1所述方法，測定聚合物對DEHP及其結(jié)構(gòu)類似物的吸附能力。

1.8.3 奶粉樣本分析

牛奶在通過擠奶機時可能被酯類污染，因此從超市購買了一種商業(yè)品牌嬰兒配方奶粉作為樣品。奶粉脂肪分離主要基于之前的研究[18]，并做了一些調(diào)整：準確稱量1 g嬰兒配方奶粉，放入50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL甲醇后，用旋渦式攪拌器混合15 min，然后添加0.5 g氯化鈉，再次均質(zhì)，超聲10 min，接著以3 500 r/min離心10 min，最后將收集到的上層清液移入試管中直接加載，或儲存于4℃冰箱中，備用。將樣品按照1.8.1的方法，采用50 mg聚合物的微型柱進行分離和6 mL洗脫液解吸?；厥章视锰砑硬煌|(zhì)量濃度DEHP標準溶液（100、200、300、400 ng/mL）的嬰兒奶粉來評估，空白對照除了未添加DEHP標準溶液外，其余采用相同的樣品制備過程?；厥章剩≧，%）的計算公式如下：

式中：Cmean表示檢測出的質(zhì)量濃度均值；Cspike表示添加的質(zhì)量濃度。

1.8.4 MIPs重復(fù)利用穩(wěn)定性分析

配置1和5μg/mL DEHP，按照1.8.1的方法進行反復(fù)吸附和洗脫，每個質(zhì)量濃度測試10次，計算回收率，以檢測MIPs的重復(fù)利用穩(wěn)定性。

1.9 計算模擬

allyl-β-CD為所有制備的雙功能單體中的一個共有單體，本試驗計算了不同第二功能單體——甲基丙烯酸（MAA）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）、丙烯腈（AN）和丙烯酰胺（AA）與模板分子的相互作用。在計算機上運行Gaussian09軟件，采用量子化學(xué)半經(jīng)驗方法對模板分子和功能單體進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，尋找能量最低的構(gòu)象，并計算各自的能量水平；再模擬第二功能單體與模板分子復(fù)合物的最低能量構(gòu)象，計算模板分子與功能單體之間的相互作用結(jié)合能（ΔE），從計算機模擬角度對不同印跡聚合物的吸附效果差異做出解釋。計算公式如下：

ΔE＝E（模板分子-功能單體復(fù)合物）-E（模板分子）-E（功能單體）。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)合試驗

2.1.1 溶劑的影響

分子印跡的特異性識別功能主要依靠以下2個因素實現(xiàn)：一是印跡腔的大小、形狀與官能團精確互補；二是模板分子與功能單體之間形成的疏水作用力和氫鍵（圖2）。溶液中的水能夠增加MIP和模板分子之間的疏水作用力，但是DEHP在水中的溶解性差，所以需要篩選甲醇和水的比例來確定最佳的結(jié)合效果。從圖3中可以看出，吸附溶劑中水和甲醇的體積比達到均衡水平（5∶5）時，吸附量最高。這也與之前的研究[10，12，19]相一致。因此，M-F（水和甲醇的體積比5∶5）被認為是最佳溶劑，被選用來進行后續(xù)的研究。此外，由于懸浮時間對印跡聚合物的吸附作用無顯著影響，因此，聚合物懸浮1 h足以產(chǎn)生最優(yōu)結(jié)果。

2.1.2 特異性吸附

平衡吸附試驗中結(jié)合到不同MIPs和NIPs上的底物量如表1所示。Kd值越高，聚合物的作用就越大。結(jié)果顯示，MIPs在各個方面都比NIPs有更強的親合力，包括Q、Kd、ΔQ和IF，表明合成的NIPs不具備印跡空穴。在各種MIPs中，AA-allyl-β-CD雙功能單體分子印跡聚合物（M-AA）的吸附量最小（≤47μmol/g），說明AA功能單體相比其他功能單體，在聚合物網(wǎng)絡(luò)中沒有形成強烈的氫鍵和疏水作用。AA功能單體在其他文獻中也被報道只有較弱的作用[12，20]。盡管allyl-β-CD MIPs（M-β-CD）的吸附量≤94μmol/g，約為M-AA的2倍，但仍顯著低于M-MAA、MMA-allyl-β-CD雙功能單體分子印跡聚合物（M-MMA）和M-AN的值。因此，當(dāng)MAA、MMA和AN單體與allyl-β-CD單體共同構(gòu)成雙功能單體時，吸附能力提高。M-MAA、M-MMA和M-AN的平均吸附量（Q）為110μmol/g，而M-β-CD和M-AA分別為90和40μmol/g。

2.1.3 動力學(xué)吸附和競爭性吸附

在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，對M-MAA、M-MMA和M-AN這3種印跡聚合物進行進一步研究。采用不同濃度（0.10～1.00 mmol/L）的 DEHP測試MIPs和NIPs對目標分子的結(jié)合能力。對聚合物在溶液中懸浮1 h的吸附量測定的結(jié)果表明：MIPs和NIPs都顯示出很好的響應(yīng)值；模板的初始濃度越高，聚合物的吸附量就越大（圖4）；3種印跡聚合物的吸附效果類似，但它們都顯著高于非印跡聚合物。

圖3 溶劑對吸附的影響Fig.3 Influence of solvent on adsorption

表1 不同功能單體制備的聚合物對DEHP的吸附量*Table1 Recognition of DEHP amount uptake on the polymers prepared with different functional monomers*

2.1.4 MISPE過程

2.1.4.1 結(jié)合吸附結(jié)果

通過MISPE方法測定的MIPs和NIPs結(jié)合吸附百分比如圖5所示。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)孜锏牧繛?μmol時，M-AN、M-MMA和M-MAA的結(jié)合吸附百分比分別為96%、94%和92%，而N-AN、NMMA、N-MAA的結(jié)合吸附百分比分別為94%、86%和91%。但當(dāng)上樣量增加到3μmol時，M-AN、M-MMA和M-MAA的結(jié)合吸附百分比則要明顯高于N-AN、N-MMA，N-MAA的，這表明上樣量增大時，用MIPs比NIPs具有更強的吸附能力。另外，在比較這3種聚合物的結(jié)合吸附百分比時，發(fā)現(xiàn)雖然所有類型的MIPs都顯示出強烈的親合力，但是M-AN無論在上樣量為1μmol還是3μmol，其平均結(jié)合吸附百分比都十分接近，所以M-AN在這3種聚合物中有更穩(wěn)定的吸附能力。

圖4 動力學(xué)吸附（A）和MIPs、NIPs的競爭性吸附（B）Fig.4 Adsorption dynamics(A)and competitive binding selectivity of the MIPs and NIPs(B)

圖5 DEHP和MIPs的結(jié)合吸附百分比Fig.5 Percentage of binding adsorption of DEPH and MIPs

2.1.4.2 競爭性吸附結(jié)果

根據(jù)圖5的結(jié)果可知，相較于M-MMA、MMAA，M-AN在不同上樣量中有著更穩(wěn)定的吸附能力，所以選擇M-AN和N-AN的高效液相色譜圖進行討論。對比圖6A和圖6B發(fā)現(xiàn)，混合溶液中的DMP和DEP在吸附結(jié)束后的洗滌過程中幾乎全部都被洗掉了，這說明DMP和DEP與M-AN結(jié)合作用非常弱；而DEHP在吸附過程中幾乎被完全回收，證明M-AN對模板有很高的選擇性，其選擇吸附能力很強。此外，通過計算得到，M-AN對DEHP、DINP、DEP和DMP的結(jié)合吸附百分比分別為97.98%、90.22%、11.55%和10.83%，這說明模板的形狀、大小和功能結(jié)構(gòu)會對聚合物的吸附能力和識別能力產(chǎn)生影響。另外，MISPE法和懸浮法的數(shù)據(jù)都表明MIPs比NIPs有更高的吸附量。

2.1.4.3 樣品測試結(jié)果

用甲醇稀釋儲備溶液，得到質(zhì)量濃度為2.5×10-3、5.0×10-3、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的標準溶液。以色譜峰面積為縱坐標，標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，建立標準曲線。標準溶液檢測3次，得到了良好的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（y=9.154x+1.923，r=0.998）。基于信噪比3∶1和10∶1，檢測極限（limit of detection,LOD）和定量極限（limit of quantification,LOQ）分別為0.045和0.139μg/mL，此靈敏度可有效地測定目標基質(zhì)中的微量殘留。使用3種添加不同質(zhì)量濃度的DEHP（n=3，100～400 ng/mL）的嬰兒配方奶粉進行試驗，平均回收率為89.06%～97.98%，樣本分析中相對標準偏差低于6.47%。同時，采用1和5μg/mLDEHP進行反復(fù)吸附和洗脫，發(fā)現(xiàn)被測的MIPs可被重復(fù)利用，且?guī)缀鯖]有質(zhì)量損失（回收率為92.13%～98.32%；相對標準偏差為1.14%～4.70%），表明MIPs具有較好的穩(wěn)定性。

圖6 高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatograms

2.2 計算機建模

圖7和圖8分別為模板、功能單體及DEHP和每個第二功能單體之間形成的復(fù)合物的優(yōu)化結(jié)構(gòu)。從表2中可發(fā)現(xiàn)，ΔE（MAA-DEHP）＜ΔE（ANDEHP）＜ΔE（MMA-DEHP）＜ΔE（AA-DEHP）。根據(jù)ΔE越小，模板分子與功能單體之間的結(jié)合能力越強的原則，表明MAA和AN有最強的結(jié)合能力，AA結(jié)合能力最弱。由此推測，結(jié)合allyl-β-CD、MAA和AN最有效，而AA作用最弱。單功能單體分子印跡聚合物由于只有allyl-β-CD與模板分子作用，少了第二功能單體的作用，因此吸附力弱于雙功能單體分子印跡聚合物。

圖7 模板和功能單體優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)Fig.7 Optimized structures of the template and functional monomers

3 討論

在本研究中，將不同體積比例的水與甲醇作為溶劑的組成部分來評估水對聚合物吸附DEHP的影響，結(jié)果表明：水產(chǎn)生的疏水作用在β-CD MIPs的識別過程中扮演了重要的角色；由于分析物為非極性，不溶于水，因此在制備吸附溶劑的過程中，選擇水體積≤甲醇體積。

分子結(jié)構(gòu)對MIPs的識別能力起到了基礎(chǔ)性作用。分子結(jié)構(gòu)的不同直接造成了MIPs對其吸附能力的差別，且不同分子之間結(jié)構(gòu)差異越大，MIPs的選擇性吸附能力也越強。所以，DMP和DEP的結(jié)構(gòu)與DEHP的差異大，使得MIPs吸附這2種物質(zhì)的能力就差。而DINP和DEHP的分子結(jié)構(gòu)非常相近，會與一部分MIPs的空穴進行互補，所以它的吸附百分比也能達到90%以上。結(jié)合所有數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，所有類型的MIPs的選擇吸附能力均強于NIPs，這表明MIPs是具有更高選擇能力的吸附劑。

在MISPE過程中MIPs和NIPs的吸附量并沒有產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上的差別，但是在相同上樣濃度（0.10 mmol/L）時，用MISPE法測得的吸附量與懸浮方法相比有顯著差異，這可能是由于在MISPE法中使用的MIPs顆粒較懸浮法多。這也說明當(dāng)聚合物顆粒增多時，更多的底物會被吸附到MIPs和NIPs上，即聚合物顆粒越多，其結(jié)合位點就越多。

將本文檢測鄰苯二甲酸酯的MISPE-HPLC方法與其他已報道的方法比較（表3）發(fā)現(xiàn)：本試驗方法的LOD高于文獻報道。這可能是由于質(zhì)譜（mass spectrometry,MS）或火焰離子化檢測器（flame ionization detector,FID）的匹配問題，但其檢測結(jié)果仍低于美國食品與藥物管理局規(guī)定的鄰苯二甲酸酯耐受極限（成人3.5μg/mL，新生兒和嬰兒0.3μg/mL）。對回收率的比較分析發(fā)現(xiàn)，本試驗方法與其他方法無顯著性差異。

圖8 DEHP與MAA（A）、AA（B）、MMA（C）、AN（D）形成的復(fù)合物優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)Fig.8 Optimized structures of the complex formed by DEHP with MAA(A),AA(B),MMA(C),AN(D),respectively

表2 能量計算值Table2 Value of the calculated energy

表3 鄰苯二甲酸酯的不同測定方法比較Table3 Comparison of different methods for determination of phthalates

4 結(jié)論

本研究采用本體聚合法制備了多種基于allylβ-CD功能單體的DEHP印跡聚合物。結(jié)果表明：吸附溶劑中含有更多的水，會誘發(fā)更多的模板材料吸附到印跡聚合物上；雙功能單體MIPs（M-MAA、M-MMA和M-AN）的吸附能力優(yōu)于單功能單體MIPs（M-β-CD）；雙功能單體MIPs的平均吸附量為110 μmol/g，單功能單體MIPs則為90 μmol/g。M-AN比M-MAA和M-MMA的吸附量略高，三者均具有較強的吸附力，在競爭性吸附試驗中，它們可以區(qū)分模板分子與其結(jié)構(gòu)類似物，并且高度優(yōu)于M-AA和M-β-CD。將M-MAA、M-MMA和MAN作為分子印跡固相萃?。∕ISPE）的固定相，分析嬰兒配方奶粉中的DEHP，其回收率范圍為89.06%～97.98%，相對標準偏差≤6.47%，說明它們可用于實際樣品分析。總之，本文制備的雙功能單體的選擇性識別吸附能力優(yōu)于單功能單體，能有效分離疏水性分子，且所用有機溶劑少，材料成本低，容易獲得，具有較好的利用前景。