李 雙 ，邱 靜 ，穆 震 ，孫 穎 ，張 超 ，韋方麗

（1.萊蕪鋼鐵集團(tuán)有限公司醫(yī)院，山東 萊蕪，271126；2.泰安市疾病預(yù)防控制中心，山東 泰安，271000；3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安，271000）

惡性黑色素瘤是一種由皮膚和其他器官黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤，具有惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移及死亡率高等特點[1]。皮膚惡性黑色素瘤在老年患者中多發(fā)，且近年來呈現(xiàn)增高的趨勢，并且在兒童中也有報道，且隨著年齡增長其發(fā)病率顯著增加[2]。因此，探討皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)病機制，尋找有效的治療方法，對于抑制腫瘤進(jìn)展，改善皮膚惡性黑色素瘤的治療效果具有重要意義。miRNA-21是一種單鏈小分子RNA，能夠通過其結(jié)構(gòu)的5’端序列與靶基因的3’端序列結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)。有報道顯示[3]，miR-21是一種原癌基因，在非小細(xì)胞肺癌、腦膠質(zhì)瘤及肺癌中表達(dá)顯著增加。與其相反，程序性死亡蛋白 4(programmed cell death 4，PDCD4)被證實是一種新的抑癌基因，PDCD4是miRNA-21的靶基因且被其負(fù)向調(diào)控。已有報道顯示[4]，在腫瘤組織及細(xì)胞中過表達(dá)PDCD4能夠顯著抑制腫瘤的增長。因此，本研究選取2016年01月-2016年8月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚外科手術(shù)切除的20例惡性黑素瘤組織及20例健康對照皮膚組織作為研究對象，探究miR-21調(diào)控PDCD4在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)及意義，現(xiàn)匯報如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年01月-2016年8月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚外科手術(shù)切除的20例皮膚惡性黑素瘤組織及20例健康對照皮膚組織作為研究對象。惡性黑色素瘤患者組織經(jīng)過外科手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)檢測證實。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及生物靶向治療，未合并其他惡性腫瘤。所得標(biāo)本均迅速放置于液氮中保存。惡性黑素瘤患者中男12例，女8例；年齡26～69歲，平均（49.62±7.36）歲。對照組中男10例，女10例；年齡23～65歲，平均（50.64±8.94）歲。兩組患者在年齡、性別等一般資料的對比上無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器及試劑 主要儀器：AB StepOne Plus實時定量PCR儀購自Life Technology公司，型號PRISM7700；電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

主要試劑：Trizol 購自美國Invitrogen公司；RIPA（強）裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time均購自Takara公司；PDCD4及β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；PDCD4及GAPDH抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2.2 Real-time PCR法檢測惡性黑色素瘤中miR-21、PDCD4 mRNA的表達(dá) 將兩組受試者的組織置于冰袋上，用鑷子夾取10 mg左右的組織于1.5 mL 離心管中，加入500 μL Trizol，采用組織勻漿機將組織研磨打碎，4 ℃ 12000 rpm離心10 min，取上清加入另一新的離心管中。加入100μL氯仿，4℃ 12000 rpm離心10 min。將上層水相吸取到另一新的并轉(zhuǎn)移至一支新離心管中，并計入同體積的異丙醇，室溫放置10 min，4 ℃ 12000 rpm離心10 min。棄掉上清加入500 μL 75%乙醇溶液，4 ℃ 12000 rpm離心10 min。將上清棄掉并置于室溫下風(fēng)干管中液體，之后加入適量無核酶水（ddH2O），室溫放置30 min復(fù)溶提取到的RNA。

采 用 One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara公司）試劑盒，按照產(chǎn)品說明書配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)體系，miRNA-21及內(nèi)參U6引物購于Takara公司。按照PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara公司）試劑盒配制反應(yīng)體系及進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time（Takara公司）試劑盒說明配制PCR反應(yīng)體系，β-actin作為內(nèi)參照進(jìn)行熒定量PCR反應(yīng)，PDCD4及β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 Western blot法檢測PDCD4蛋白的表達(dá)同樣夾取10 mg左右的病理組織，采用勻漿器勻漿，加入50μL組織裂解液，冰上反應(yīng)30 min。4℃12000 rpm離心10 min，吸取上清于新的離心管中，并加入適量loading buffer，100℃煮沸10 min。之后通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、敷一抗、洗膜、敷二抗及發(fā)光等過程，獲得western blot條帶。用Lab Works軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)目的條帶灰度值/β-actin灰度值的比值計算每組目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，獨立樣本采用t檢驗，單因素方差分析采用SNK-qSNK進(jìn)行多樣本均數(shù)的兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試者組織中miR-21和PDCD4 mRNA的表達(dá)

real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與正常皮膚組織相比，惡性黑素瘤組織中miR-21含量顯著增加（P＜0.05），而PDCD4 mRNA含量顯著降低（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組受試者組織中PDCD4 蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，PDCD4蛋白在健康對照皮膚組織和惡性黑素瘤組織中的相對表達(dá)量分別為1.04±0.18和0.35±0.26，由此可見健康對照皮膚組織中PDCD4 蛋白的表達(dá)水平顯著高于惡性黑素瘤組織中，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 兩組受試者組織中miR-21和PDCD4 mRNA的表達(dá)（±s）

表1 兩組受試者組織中miR-21和PDCD4 mRNA的表達(dá)（±s）

組別 miR-21 PDCD4 mRNA對照組(n=20) 0.96±0.14 1.03±0.31惡性黑素瘤組(n=20) 4.64±2.25 0.33±0.18 t 7.300 8.733 P 0.000 0.000

圖1 兩組受試者組織中PDCD4 蛋白表達(dá)

3 討 論

惡性黑色素瘤采用手術(shù)難以完全切除，且對放化療等治療措施不敏感，有報道稱，惡性黑色素瘤晚期患者的中位生存期僅為6個月，5年生存率低于5%[5]，因此，探究黑色素瘤的發(fā)病機制是當(dāng)務(wù)之急。

miRNA-21是一個最近報道較多的致癌miRNA，周啟明等的研究結(jié)果顯示，黑色素瘤患者的血清中miR-21的含量顯著增加，且與一致黑色素瘤細(xì)胞的凋亡存在一定聯(lián)系。有研究結(jié)果提示[6]，miR-21可能參與了惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Wang[7]等的一項meta分析顯示，血清中循環(huán)miR-21是一種預(yù)測腫瘤發(fā)生的良好血清標(biāo)志物，且其含量與預(yù)后相關(guān)，但在惡性黑色素瘤組織中miR-21的表達(dá)研究較少。因此，本研究測定健康對照組皮膚組織及惡性黑色素瘤皮膚組織中miR-21的表達(dá)，結(jié)果顯示，惡性黑色素瘤皮膚組織中miR-21的表達(dá)顯著增加。以上結(jié)論充分顯示出miR-21參與了惡性黑色素瘤的發(fā)病進(jìn)程。

PDCD4是一種調(diào)控程序性死亡的蛋白，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞正常凋亡，是一種重要的抗癌因子。更重要的是，有許多研究顯示[8-9]，PDCD4作為miR-21的調(diào)控因子，在許多腫瘤的發(fā)生中起重要作用。段倞彥[10]等的研究發(fā)現(xiàn)，腎癌患者的腎癌組織及癌旁組織中，miR-21的表達(dá)均顯著增高，而PDCD4的表達(dá)顯著降低，兩者表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢，且與腫瘤分化程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對照組皮膚組織相比，惡性黑色素瘤患者皮膚組織中PDCD4的mRNA及蛋白水平顯著降低。由此可見，PDCD4在惡性黑色素瘤患者的機體中呈現(xiàn)低表達(dá)的狀態(tài)，且這種低表達(dá)可能與miR-21的負(fù)性調(diào)控相關(guān)。

綜上所述，惡性黑素瘤組織中miR-21水平顯著增加，而PDCD4 mRNA水平及蛋白水平顯著降低，可能參與了惡性黑色素瘤的發(fā)病過程，為惡性黑色素瘤的臨床治療提供了科學(xué)依據(jù)，但兩者之間的具體調(diào)控機制還需要進(jìn)一步探討。