高華武， 龍子江， 王舒舒， 王 靚， 陳 明

（安徽中醫(yī)藥大學中藥復方安徽省重點實驗室， 安徽 合肥230012）

中國書畫墨作為“文房四寶” 之一， 以明代嘉靖之后產(chǎn)自徽州者最佳。 到清末民初， 胡開文徽墨選料奇特， 獨具匠心， 將徽墨推向了全球市場［1］， 其中以名貴中藥材配制供藥用的墨——八寶五膽藥墨以水牛角、 羚羊角、 蟾酥、珍珠、 花紅、 牛黃、 麝香、 朱砂8 味珍貴藥材， 以及熊膽、蛇膽、 青魚膽、 牛膽、 豬膽5 種動物膽制藥入墨， 結合其他藥材共20 余味， 具有消炎解毒、 活血止痛、 涼血止血、消腫軟堅、 防腐收斂功效［2-3］， 還能抑制炎癥因子， 對腫瘤有一定治療作用［4］。 為探討長期使用八寶五膽藥墨的安全性， 本研究將進行24 周大鼠長期毒性實驗， 觀察它對肝腎功能、 血糖、 血脂變化的影響。

1 材料

1.1 藥物 八寶五膽藥墨由安徽墨藥制藥有限公司提供，批號130503， 臨用時用蒸餾水配制。

1.2 動物 SD 大鼠120 只， 雌雄各半， 體質(zhì)量80 ～90 g，由安徽省動物實驗中心提供， 動物生產(chǎn)許可證編號SCXK（皖） 2016-002。

1.3 儀器 AU680 型全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）； TS-12 生物組織自動脫水機、 BM-VII 生物組織包埋機（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）； YD-315 輪轉(zhuǎn)式切片機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）； YT-6C 生物組織攤烤片機（孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 120 只大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后， 根據(jù)《中藥、 天然藥物長期毒性研究技術指導原則》 和文獻［5-7］ 隨機均分成4 組， 每組雌雄大鼠各15 只， 分別為八寶五膽藥墨低劑量（2.5 生藥／kg）、 中劑量（5.0 生藥／kg）、高劑量 （10.0 生藥／kg） 組 （相當于成人臨床日用量3.24 g 生藥／d 的46、 92、 185 倍） 及正常對照組（等容量蒸餾水）。 各組大鼠灌胃給藥， 劑量0.5 mL／100 g 體質(zhì)量，連續(xù)24 周。

2.2 指標檢測

2.2.1 生化指標 分別于給藥12、 24 周及停藥2 周后，每組隨機選取10 只大鼠（雌雄各半）， 3.5% 水合氯醛麻醉， 腹主動脈取血， 分離血清， 檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（AST）、 堿性磷酸酶（ALP）、 白蛋白（ALB）、 血漿總蛋白（TP）、 總膽紅素（TBi）、 直接膽紅素（DBIL）、 血清尿素氮（BUN）、 肌酐（CREA）、 血糖（Glu）、 甘油三酯（TG）、 總膽固醇（CHOL） 水平。

2.2.2 病理指標 處死大鼠， 肉眼觀察心、 肝、 脾、 肺、腎、 腎上腺、 胸腺、 胰腺、 子宮、 卵巢、 睪丸、 前列腺，并進行病理切片， 光鏡下檢測其組織變化。

2.3 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理， 數(shù)據(jù)以（±s） 表示， 組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義， 評價時綜合考慮統(tǒng)計學差異和生物學意義［8］。

3 結果

3.1 八寶五膽藥墨對大鼠肝腎功能的影響 雄性大鼠給藥12 周后， 八寶五膽藥墨中劑量組AST、 ALB、 BUN 水平顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）， 高劑量組AST 水平顯著升高（P＜0.01）； 停藥2 周后， 高劑量組DBIL 水平顯著降低（P＜0.05）。 雌性大鼠給藥24 周后， 八寶五膽藥墨低劑量組ALP 水平顯著升高（P＜0.05）， 中劑量組ALP 水平顯著升高（P＜0.01）， 高劑量組ALP 水平顯著升高（P＜0.01），AST、 ALB、 DBIL 水平顯著降低（P＜0.05）； 停藥2 周后，低劑量組TBIL、 DBIL 水平顯著降低（P＜0.01）， 高劑量組ALB、 DBIL 水平顯著降低（P＜0.05）。 但經(jīng)分析后認為，AST、 ALP、 ALB 水平變化無明顯劑量、 性別相關性， 也無明顯毒理學意義； TBIL、 DBIL、 BUN 水平變化幅度不大，為正常生理波動。 見表1～2。

表1 八寶五膽藥墨對雄性大鼠肝腎功能的影響（±s， n＝5）

表1 八寶五膽藥墨對雄性大鼠肝腎功能的影響（±s， n＝5）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 時間 正常對照組 八寶五膽藥墨低劑量組 八寶五膽藥墨中劑量組 八寶五膽藥墨高劑量組ALT／（U·L-1）給藥12 周 27.40±3.51 31.80±10.52 52.61±37.66 35.00±6.78給藥24 周 55.20±7.12 48.60±5.68 47.60±10.90 46.40±9.45停藥2 周 39.40±21.78 46.60±11.06 47.80±4.27 50.00±4.06 AST／（U·L-1）給藥12 周 122.40±21.51 138.00±32.19 212.40±34.11?? 173.40±26.44??給藥24 周 247.00±66.81 214.40±69.82 222.80±66.35 229.00±64.33停藥2 周 178.60±85.43 176.20±44.03 142.20±28.22 131.00±22.79 ALP／（U·L-1）給藥12 周 121.20±45.55 112.20±29.04 117.20±33.68 139.20±54.58給藥24 周 105.80±23.89 119.20±44.30 155.00±57.11 126.00±94.67停藥2 周 81.74±46.96 89.00±20.29 108.40±24.96 122.60±19.50 ALB／（U·L-1）給藥12 周 33.78±1.34 31.28±1.39 30.90±1.94? 31.94±1.63給藥24 周 31.32±1.91 32.40±1.97 30.30±2.95 33.14±7.47停藥2 周 36.98±13.89 31.94±2.85 30.06±1.69 29.66±0.27 TP／（g·L-1）給藥12 周 59.86±1.85 63.54±4.77 59.12±4.96 60.40±5.43給藥24 周 61.84±2.77 63.10±2.33 65.62±3.79 62.48±2.27停藥2 周 51.22±27.63 67.06±3.39 64.34±2.92 64.86±1.11 TBIL／（μmol·L-1）給藥12 周 0.60±0.55 0.30±0.22 0.36±0.24 0.78±0.42給藥24 周 1.54±2.12 1.68±0.51 1.62±1.11 1.10±0.28停藥2 周 2.30±0.67 3.20±1.13 3.00±0.71 2.10±0.22 DBIL／（g·L-1）給藥12 周 0.40±0.36 0.25±0.19 0.29±0.25 0.46±0.31給藥24 周 0.88±0.58 0.60±0.31 0.56±0.34 0.40±0.35停藥2 周 1.78±1.26 1.40±0.55 0.80±0.45 0.20±0.45?BUN／（mol·L-1）給藥12 周 5.08±0.38 4.90±0.60 6.38±1.16? 5.56±0.53給藥24 周 6.02±1.81 5.90±2.09 7.40±1.48 6.12±1.89停藥2 周 10.70±7.79 7.74±1.83 6.52±0.48 6.84±0.99 CREA／（μmol·L-1）給藥12 周 59.06±4.92 60.08±5.20 68.64±11.70 64.44±18.49給藥24 周 74.20±28.20 71.72±10.78 71.00±27.90 65.16±19.36停藥2 周 86.64±68.19 103.24±10.62 103.24±10.62 95.18±10.73

表2 八寶五膽藥墨對雌性大鼠肝腎功能的影響（±s， n＝5）

表2 八寶五膽藥墨對雌性大鼠肝腎功能的影響（±s， n＝5）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 時間 正常對照組 八寶五膽藥墨低劑量組 八寶五膽藥墨中劑量組 八寶五膽藥墨高劑量組ALT／（U·L-1）給藥12 周 28.00±4.47 29.00±9.71 28.00±3.54 30.40±6.43給藥24 周 44.60±13.74 41.20±6.65 39.20±10.78 42.40±5.08停藥2 周 40.00±10.70 48.40±9.96 39.20±7.05 38.00±7.84 AST／（U·L-1）給藥12 周 104.40±8.85 125.40±28.63 127.20±29.39 148.00±8.40給藥24 周 179.40±37.63 134.60±26.52 128.80±17.92? 154.00±10.93停藥2 周 107.80±15.22 133.60±40.06 106.00±18.72 101.60±15.18 ALP／（U·L-1）給藥12 周 77.40±46.15 80.60±26.71 77.60±36.21 61.00±13.67給藥24 周 42.20±11.21 77.60±30.09? 125.40±44.12?? 137.40±47.11?停藥2 周 76.40±54.10 69.40±24.06 74.20±26.35 74.00±23.54 ALB／（U·L-1）給藥12 周 33.80±1.55 32.02±4.79 36.06±2.64 35.64±1.39給藥24 周 39.36±1.69 40.16±1.92 35.64±2.76? 35.84±3.56停藥2 周 39.14±3.43 36.08±2.82 35.22±3.76 34.00±3.51?TP／（g·L-1）給藥12 周 64.00±3.47 63.84±7.04 64.80±2.22 64.74±3.33給藥24 周 76.48±4.39 73.58±2.34 67.60±7.54 70.64±1.49停藥2 周 73.32±4.00 69.42±3.76 75.16±4.49 70.12±3.61 TBIL／（μmol·L-1）給藥12 周 1.00±0.8 0.33±0.24 0.64±0.47 0.80±0.45給藥24 周 1.38±0.39 1.10±0.22 1.00±0.00 1.38±0.39停藥2 周 2.70±0.45 2.00±0.00?? 2.70±0.27 2.80±0.27 DBIL／（g·L-1）給藥12 周 0.80±0.45 0.28±0.24 0.59±0.41 0.72±0.38給藥24 周 0.70±0.41 0.62±0.26 0.26±0.05? 0.90±0.17停藥2 周 1.78±1.26 1.00±0.00?? 0.80±0.45 1.00±0.00?BUN／（mol·L-1）給藥12 周 5.70±0.77 6.56±2.24 4.32±1.16 6.36±1.34給藥24 周 8.14±0.41 7.56±0.60 7.20±2.51 7.02±1.16停藥2 周 6.22±0.44 7.84±1.19 7.64±1.30 6.58±0.65 CREA／（μmol·L-1）給藥12 周 65.92±8.45 75.00±17.90 54.20±12.60 65.16±4.07給藥24 周 96.06±21.81 67.42±5.11 64.76±9.06 73.18±14.46停藥2 周 96.48±18.38 98.54±9.44 113.06±13.11 102.54±15.07

3.2 八寶五膽藥墨對大鼠血糖、 血脂的影響 雄性大鼠給藥12 周后， 高劑量組TG 水平顯著升高（P＜0.05）； 停藥2 周后， 高劑量組TG 水平顯著升高（P＜0.05）。 雌性大鼠給藥12 周后， 中劑量組Glu、 TG 水平顯著升高 （P ＜0.01）； 給藥24 周后， 中劑量組TG 水平顯著升高（P ＜0.05）。 但經(jīng)分析認為， Glu、 TG 水平升高無明顯劑量、 性別相關性， 而且幅度不大， 為正常生理波動， 無明顯毒理學意義。 見表3。

表3 八寶五膽藥墨對大鼠血糖、 血脂的影響（±s， n＝5）

表3 八寶五膽藥墨對大鼠血糖、 血脂的影響（±s， n＝5）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

指標 性別 時間 正常對照組 八寶五膽藥墨低劑量組 八寶五膽藥墨中劑量組 八寶五膽藥墨高劑量組Glu／（nmol·L-1）雄性 給藥12 周 4.79±0.87 3.87±1.07 4.54±2.68 3.80±2.40給藥24 周 8.12±4.58 8.78±2.11 3.96±1.98 6.54±4.45停藥2 周 7.44±3.68 7.23±2.71 4.33±0.84 5.01±0.70雌性 給藥12 周 5.08±0.81 4.49±1.01 8.71±1.57?? 4.30±1.33給藥24 周 5.93±1.55 7.54±0.55 6.45±2.48 7.45±2.41停藥2 周 8.10±2.26 7.55±1.41 6.18±1.11 7.96±1.67 TG／（mmol·L-1）雄性 給藥12 周 1.12±0.29 1.11±0.42 0.96±0.32 1.79±0.43?給藥24 周 8.37±17.12 0.81±0.25 0.59±0.16 0.63±0.35停藥2 周 0.56±0.09 0.75±0.31 0.45±0.10 0.84±0.20?雌性 給藥12 周 0.70±0.18 0.96±0.29 1.71±0.53?? 7.52±14.52給藥24 周 0.49±0.18 0.68±0.22 0.86±0.29? 0.62±0.24停藥2 周 0.59±0.17 0.61±0.13 0.52±0.07 0.52±0.16 CHOL／（mmol·L-1）雄性 給藥12 周 1.66±0.17 2.24±0.41 1.80±0.62 2.10±0.41給藥24 周 1.95±0.08 1.87±0.25 1.75±0.37 1.97±0.40停藥2 周 1.52±0.52 1.80±0.44 1.36±0.38 1.77±0.18雌性 給藥12 周 1.96±0.49 2.29±0.45 2.62±0.44 2.62±0.60給藥24 周 2.26±0.59 2.66±0.56 2.18±0.55 2.44±0.32停藥2 周 2.22±0.19 2.22±0.39 2.15±0.42 2.09±0.29

3.3 對大鼠臟器組織的影響 處死大鼠后解剖， 肉眼未發(fā)現(xiàn)臟器組織有明顯變化。 鏡下檢測顯示， 給藥12、 24 周及停藥2 周后， 除個別大鼠脾臟有輕度淤血， 肝臟肝門管區(qū)有少量炎細胞浸潤， 肝細胞有輕度細胞水腫外， 其他大鼠臟器組織均無明顯變化。

4 討論

以藥入墨在我國具有悠久的歷史， 將書畫墨與中藥結合制成的八寶五膽藥墨既是我國優(yōu)秀的墨工藝品， 又兼具中醫(yī)藥治療疾病的功效。 八寶五膽藥墨由20 余味名貴中藥制成， 方中水牛角清熱解毒， 涼血止血； 羚羊角、 珍珠、牛黃為寒涼之品， 除熱涼血， 清風祛痰， 清肝解毒［9］； 冰片清熱止痛， 引風熱濕邪而出， 牛膽、 豬膽清肝熱， 利膽通腸， 清中下焦?jié)駸幔?藕節(jié)、 大小薊、 牡丹皮、 白茅根清熱涼血， 散結消瘀； 麝香、 蟾酥、 丁香、 川芎、 紅花逐風散滯， 養(yǎng)血行氣止痛； 松煙藥墨隨血通達全身， 收毒解毒，調(diào)和諸藥［10-11］， 全方共奏涼血止血、 息風清熱、 清腫止痛之功效［12］。 雖然八寶五膽藥墨功效仍有待現(xiàn)代藥理實驗進行證實， 但由麝香、 羚羊角、 牛黃、 蛇膽、 珍珠等中藥制成的八寶丹能抑制胃癌細胞AGS、 MGC-803 增殖， 誘導細胞凋亡［13］； 含有牛黃、 犀角、 麝香、 冰片成分的安宮牛黃丸能改善腦出血后的神經(jīng)功能， 減輕腦水腫， 對腦出血具有治療作用［14］； 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 八寶五膽藥墨能抑制炎癥因子， 對腫瘤有一定治療作用［4］。

本實驗發(fā)現(xiàn)， 大鼠按2.5、 5.0、 10.0 g 生藥／kg （按體質(zhì)量計算， 分別相當于臨床成人日用量3.24 g 生藥／d 的46、 92、 185 倍； 按體表面積計算， 分別相當于8、 17、 34倍） 劑量給予八寶五膽藥墨12、 24 周及停藥2 周后， 僅個別大鼠肝腎功能指標有差異， 但并無毒理學意義， 并且臟器組織也無明顯變化， 表明其長期用藥毒性較小， 安全性良好。