郝 悅， 焦安妮， 于 敏， 高金芝， 何 鑫， 張夢(mèng)鵠， 焦連慶?， 張 晶?

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春130118； 2. 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)所， 吉林 長(zhǎng)春130012； 3. 吉林大學(xué)藥學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春130121）

黃嘌呤氧化酶是一種復(fù)合黃素酶， 也是體內(nèi)核酸代謝的重要酶， 其作用是將體內(nèi)黃嘌呤和次黃嘌呤氧化后生成尿酸， 該成分產(chǎn)生過多、 腎臟尿酸排泄障礙或這2 個(gè)因素的綜合作用將導(dǎo)致高尿酸血癥發(fā)生［1-2］。 在我國(guó)， 痛風(fēng)已成為僅次于糖尿病的第二大代謝類疾病， 患者高達(dá)8 000 萬(wàn)人， 故抑制黃嘌呤氧化酶活性， 從根本上減少體內(nèi)尿酸產(chǎn)生， 是治療高尿酸血癥的重要途徑之一。 目前， 臨床上使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑主要為別嘌呤醇， 但在顯著治療痛風(fēng)的同時(shí)存在嚴(yán)重的毒副作用， 約2%的患者對(duì)該藥物過敏， 約3% ～10%的患者在治療過程中出現(xiàn)不良反應(yīng)［3］， 從而限制了其臨床應(yīng)用，故開發(fā)出新型抑制劑具有重要意義。

黃酮存在于蔬菜、 水果、 牧草、 藥用植物中，具有廣泛的藥理活性， 包括抗腫瘤、 清除自由基、抗病毒等［4-5］， 而且毒副作用小。 文獻(xiàn)報(bào)道， 一些植物所含總黃酮能抑制黃嘌呤氧化酶活性［6-8］， 故本實(shí)驗(yàn)考察30 種黃酮其抑制作用， 從而篩選出活性成分， 為治療高尿酸血癥奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性ICR 小鼠， 體質(zhì)量22 ～25 g， 購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司， 動(dòng)物許可證號(hào)SCXK- （吉） 011-0007， 飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)要求。 小鼠自由飲食飲水， 室溫23.0～25.0 ℃， 濕度55% ～65%， 每天更換墊料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 試藥 槲皮素、 木犀草素、 芹菜素、 水飛薊賓、 山柰酚、 二氫楊梅素、 蘆?。兾骰劭浦参镩_發(fā)有限公司， 含有量＞98%）； 白楊素、 黃芩素、漢黃芩素、 高良姜素、 大豆苷、 黃豆黃苷、 染料木素、 染料木苷、 山柰酚-3-O-蕓香糖、 橙皮素（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司， 含有量＞98%）； 楊梅素、 花旗松素、 柚皮素、 甘草素、 葛根素、 山姜素、 大豆黃素、 黃豆黃素、 異鼠李素、 黃芩苷、 野黃芩苷、 甘草苷、 木犀草苷（南京源植科技有限公司， 含有量＞98%）。 黃嘌呤、 黃嘌呤氧化酶、別嘌呤醇、 氧嗪酸鉀購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司； 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 黃嘌呤氧化酶、 尿酸、 尿素氮、 肌酐試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 BP211D 電子天平（萬(wàn)分之一， 德國(guó)Sartorius 公司）； KQ-250DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； TGL-16G 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）； SpectraMax Plu384續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海） 有限公司］； UV-1801 紫外分光光度計(jì)［北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)） 有限責(zé)任公司］。

2 方法

2.1 黃嘌呤氧化酶活性抑制作用測(cè)定

采用改良的HPLC 法［9-10］。 取不同質(zhì)量濃度供試品各200 μL、 黃嘌呤氧化酶400 μL （20 U／L），37 ℃下孵化15 min 后， 加入黃嘌呤貯備液400 μL（0.4 μmol／L） 啟動(dòng)反應(yīng)， 37 ℃下反應(yīng)30 min 后，在反應(yīng)液中加入鹽酸500 μL （1 mol／L） 終止反應(yīng)，反應(yīng)液用PBS 緩沖液（pH 7.5） 定容至2 mL， 即得供試品溶液， 取20 μL 進(jìn)行分析， 平行3 次， 取峰面積平均值。

色譜條件為流動(dòng)相0.02 mol／L KH2PO4（含1%甲醇）； 檢測(cè)器DAD 檢測(cè)器； 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；體積流量1.0 mL／min； 柱溫室溫； 進(jìn)樣量20 μL。再計(jì)算抑制率， 公式為抑制率＝ ［（A-C） ／ （BC） ］ ×100% （A 為加入抑制劑的反應(yīng)體系30 min反應(yīng)液中黃嘌呤質(zhì)量濃度， B 為未加入抑制劑的反應(yīng)體系0 min 反應(yīng)液中黃嘌呤質(zhì)量濃度， C 為未加入抑制劑的反應(yīng)體系30 min 反應(yīng)液中黃嘌呤質(zhì)量濃度）， 根據(jù)抑制率和樣品質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸， 測(cè)定IC50。

2.2 建模、 分組、 給藥 120 只小鼠隨機(jī)分為空白組、 模型組、 別嘌呤醇組及4 種黃酮高、 中、 低劑量組， 每組8 只。 各組小鼠每天灌胃1 次， 連續(xù)7 d， 空白組、 模型組小鼠給予等劑量0.5%CMC-Na， 別嘌呤醇按10 mg／（kg·d）劑量給藥，黃酮組按相應(yīng)劑量給藥。 末次給藥前1 h， 除空白組外各組小鼠腹腔注射270 mg／kg 氧嗪酸鉀鹽以建立高尿酸血癥小鼠模型， 空白組小鼠腹腔注射等量0.5% CMC-Na。 1 h 后， 各組小鼠摘除眼球取血，測(cè)定血清尿酸、 黃嘌呤氧化酶、 尿素氮、 肌酐水平。

2.3 血清尿酸、 黃嘌呤氧化酶水平檢測(cè) 取血液樣品， 室溫下凝固30 min 后， 3 500 r／min 離心取上清液， 尿酸試劑盒（磷鎢酸法） 檢測(cè)血清尿酸水平， 黃嘌呤氧化酶試劑盒（分光光度法） 檢測(cè)血清黃嘌呤氧化酶水平。

2.4 腎臟功能檢測(cè) 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備血清， 脲酶法檢測(cè)血清尿素氮水平， 肌氨酸氧化酶法檢測(cè)血清肌酐水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用（±s）表示， 多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）， 組間均數(shù)比較采用獨(dú)立t 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 活性成分篩選 表1 顯示， 12 種黃酮（占比43%） 在120 μmol／L 濃 度 下、 9 種 黃 酮 （占 比30%） 在60 μmol／L 濃度下對(duì)黃嘌呤氧化酶有抑制作用； IC50值最小的為木犀草素、 槲皮素、 芹菜素、山柰酚（42.02、 120.22、 135.98、 184.36 μmol／L），故選擇四者作為活性成分進(jìn)行下一步體外實(shí)驗(yàn)。 另外， 別嘌呤醇作為一種常用的黃嘌呤氧化酶抑制劑， 在相同條件下IC50為126.57 μmol／L， 抑制效果不如木犀草素和槲皮素， 故再進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

表1 活性成分篩選結(jié)果Tab.1 Results of active constituent screening

3.2 對(duì)小鼠血清尿酸、 黃嘌呤氧化酶的影響 圖1 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠血清尿酸、 黃嘌呤氧化酶水平顯著升高（P＜0.01）， 表明造模成功； 與 模 型 組 比 較， 木 犀 草 素 組 （20、 40、80 mg／kg）、 芹菜素組 （200 mg／kg）、 山柰酚組（150、 300 mg／kg） 顯著降低尿酸水平（P＜0.05，P＜0.01）， 而木犀草素組（20、 40、 80 mg／kg）、 芹菜素組（200 mg／kg）、 山柰酚組（150、 300 mg／kg）顯著降低黃嘌呤氧化酶水平（P＜0.05， P＜0.01），其中木犀草素80 mg／mL 組與別嘌呤醇組最接近，作用最強(qiáng)。 另外， 槲皮素組兩者水平均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

圖1 4 種黃酮對(duì)小鼠血清尿酸、 黃嘌呤氧化酶水平的影響Fig.1 Effects of four flavonoids on mouse serum levels of uric acid and xanthine oxidase

3.3 對(duì)小鼠血清尿素氮、 肌酐水平的影響 圖2顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠血清尿素氮、 肌酐水平顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）， 表明造模成功； 與模型組比較， 木犀草素組 （20、 40、80 mg／kg）、 芹菜素組 （200 mg／kg）、 山柰酚組（300 mg／kg） 顯著降低尿素氮水平（P＜0.05， P＜0.01）， 而木犀草素組（80 mg／kg） 顯著降低肌酐水平（P＜0.05）。

4 討論

近年來(lái)， 高尿酸血癥發(fā)病率顯著年輕化［11-12］，并被認(rèn)為是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［13］。 目前，用于減少尿酸的藥物主要是西藥， 如別嘌呤醇、 苯溴馬隆、 非布索坦等， 可抑制合成， 促進(jìn)尿酸排泄， 雖然藥物作用靶點(diǎn)清晰有效， 但副作用嚴(yán)重，長(zhǎng)期服用可引起肝腎損傷、 發(fā)熱、 皮疹、 骨髓抑制等副作用［14-16］； 源自天然產(chǎn)物的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有來(lái)源廣泛、 安全性高的特點(diǎn)， 許多含黃酮的蔬菜［17-18］、 真菌［19］、 植物［20-21］都具有該作用。

圖2 4 種黃酮對(duì)小鼠血清尿素氮、 肌酐水平的影響Fig.2 Effects of four flavonoids on mouse serum levels of urea nitrogen and creatinine

本實(shí)驗(yàn)篩選了30 種黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用， 發(fā)現(xiàn)木犀草素、 槲皮素、 芹菜素、 山柰酚IC50值最低， 即抑制作用最強(qiáng)［22］， 而且給予四者后高尿酸血癥小鼠血清尿酸、 黃嘌呤氧化酶水平顯著降低。 尿素氮、 肌酐是腎功能指標(biāo)， 腎功能損害時(shí)將導(dǎo)致兩者水平升高［23］， 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以上4 種黃酮對(duì)兩者水平的影響程度不如尿酸、 黃嘌呤氧化酶水平顯著， 推測(cè)可能對(duì)小鼠腎臟中尿酸排泄無(wú)明顯影響， 需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

然后， 分析了30 種黃酮的結(jié)構(gòu)， 發(fā)現(xiàn)對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用依次為黃酮＞黃酮醇＞異黃酮＞二氫黃酮＞二氫黃酮醇＞黃酮苷， 可能與成分脂溶性、 羥基位置、 氫鍵有關(guān)。 其中， 黃酮、 黃酮醇為平面型分子， 堆砌緊密， 分子間引力較大， 脂溶性較強(qiáng)； 二氫黃酮、 二氫黃酮醇為非平面分子， 分子間引力降低， 有利于水分子進(jìn)入， 脂溶性降低； 異黃酮的B 環(huán)受吡喃環(huán)羰基的立體阻礙形成非平面分子， 故脂溶性降低； 黃酮中的羥基被糖苷化后，水溶性增加， 脂溶性降低， 而脂溶性增加可使其更容易與黃嘌呤氧化酶的疏水活性中心結(jié)合， 從而表現(xiàn)出良好的酶抑制活性［24］； 黃酮中C5和C7位上的羥基與C2-C3之間的雙鍵能明顯提高該成分抑制黃嘌呤氧化酶的作用［25］。

綜上所述， 3 種黃酮（木犀草素、 山柰酚、 芹菜素） 可作為預(yù)防和治療小鼠高尿酸血癥的潛在藥物， 能為進(jìn)一步研究痛風(fēng)提供新思路， 同時(shí)也為相關(guān)資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。