王磊，曾夏蕓，任政華

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院制藥工程系，廣東 廣州 510642；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

芋螺毒素是新型海洋藥物的重要資源庫(kù)，在芋螺毒素中存在大量、高豐度的翻譯后修飾。芋螺毒素是直接的基因產(chǎn)物，其多種多樣的修飾是由不同的酶系統(tǒng)在基因翻譯后催化生成的。芋螺毒素編碼基因在核糖體中經(jīng)過(guò)翻譯后，產(chǎn)生70-120個(gè)氨基酸的前體肽，前體肽到成熟肽的過(guò)程中發(fā)生了蛋白酶切割、二硫鍵形成等過(guò)程，除此之外，還存在很多針對(duì)單個(gè)氨基酸的翻譯后修飾，如脯氨酸的羥化、谷氨酸的羧化和色氨酸的溴化等，在芋螺毒素中已發(fā)現(xiàn)了10種以上的翻譯后修飾[1-2]。

芋螺毒素翻譯后修飾可使單一基因生成不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的多肽分子，大大增加了芋螺毒素的多樣性，增強(qiáng)了毒素對(duì)靶分子的識(shí)別能力與專一性，同時(shí)也提高了芋螺毒素分子對(duì)蛋白酶的抗性，改變了修飾后毒素的物理化學(xué)性質(zhì)[3]。翻譯后修飾在不同的芋螺毒素中的分布很不均一，有些芋螺毒素除了基本的蛋白酶切割和二硫鍵形成外沒(méi)有其他修飾，而有些芋螺毒素家族則被高度修飾，如僅13個(gè)氨基酸組成的芋螺毒素tx5a，就含有兩個(gè)羧化谷氨酸、一個(gè)溴化色氨酸、一個(gè)羥化脯氨酸和一個(gè)糖基化的蘇氨酸，再加上二硫鍵的形成，總共涉及到5種不同的翻譯后修飾體系[4]。

羥化脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)是一種在芋螺毒素中廣泛存在的翻譯后修飾。最早在μ-芋螺毒素GIIIA中發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)Hyp[5]，隨后在多個(gè)超家族芋螺毒素中均發(fā)現(xiàn)含該修飾的殘基，但是羥化脯氨酸在芋螺毒素中起的作用尚不能明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，含不同羥脯氨酸殘基的μ-芋螺毒素GIIIA和GIIIB都有生物學(xué)活性，說(shuō)明Hyp不影響GIIIA和GIIIB生物學(xué)活性[6]；芋螺毒素ε-TxIX序列中的含有的Hyp可能對(duì)受體的識(shí)別和結(jié)合有所影響[7]。Contryphan家族的Lo959和Am975具有同樣的氨基酸序列，區(qū)別是前者在第3位上是脯氨酸，后者是Hyp，兩者的受體都是高電壓激活的Ca2+通道，但是作用卻完全相反，Lo959能增大Ca2+電流，而Am975具有抑制Ca2+電流的活性，不過(guò)這種相反的作用結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證[8]。ω-芋螺毒素GVIA 的Hyp10和Hyp21被脯氨酸替換后，對(duì)毒素的生物學(xué)活性及對(duì)受體N型電壓門控鈣離子通道的作用沒(méi)有影響，NMR結(jié)果顯示僅對(duì)毒素的三維結(jié)構(gòu)有一定的影響[9]。ω-芋螺毒素MVIIC的序列中脯氨酸突變?yōu)榱u脯氨酸后，會(huì)提高多肽體外折疊的效率[10]。上述的研究表明，Hyp對(duì)芋螺毒素的體外折疊和活性都有一定的影響，但其在芋螺毒素中存在的生物學(xué)意義及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的闡明[10]。

我們?cè)谇捌谘芯恐?，從信?hào)芋螺(Conuslitteratus)毒管中分離鑒定得到一個(gè)M-超家族芋螺毒素lt3a，經(jīng)過(guò)Edman降解和質(zhì)譜分析，推測(cè)lt3a含有兩個(gè)羧化谷氨酸和一個(gè)羥化脯氨酸，進(jìn)一步的對(duì)其cDNA序列進(jìn)行分析，確定芋螺毒素lt3a的氨基酸序列為DγCCγOQWCDGACDCCS, γ 代表羧基化谷氨酸，O代表羥基化脯氨酸[12-13]。為進(jìn)一步研究芋螺毒素中脯氨酸羥基化修飾的功能，本研究應(yīng)用化學(xué)合成的方法，制備了未經(jīng)脯氨酸修飾的多肽lt3a和第6位為Hyp的lt3a[P6O]，并進(jìn)一步的對(duì)其氧化折疊效率、熱穩(wěn)定性和生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。該研究為闡明芋螺毒素羥脯氨酸的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

Fmoc保護(hù)修飾的氨基酸購(gòu)自成都凱泰；Fmoc-L-4-Hydroxyproline購(gòu)自J&K chemical Ltd.；樹脂購(gòu)自上海吉爾生化；氧化型和還原型谷胱甘肽(GSSG和GSH)購(gòu)自Amresco公司。CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)、DTT、碘乙酰胺、碳酸氫銨購(gòu)自Sigma， ZipTip購(gòu)自Millipore；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 溶液配制

裂解液試劑R：φ, 三氟乙酸 90%，苯甲硫醚5%，二巰基乙烷3%，苯甲醚2%。

茚三酮指示劑： 2.5 g茚三酮固體溶于50 mL無(wú)水乙醇，充分振搖使固體完全溶解，保存在棕色試劑瓶中。

GSSG/GSH氧化溶液：100 mmol Tris-HCl，0.1 mmol EDTA，1 mmol GSSG， 1 mmol GSH，pH7.8。

任氏液：NaCl 6.5 g，KCl 0.14 g，CaCl20.12 g，NaH2PO40.01 g，pH 7.2，定容至1 L。

1.3 主要儀器

Waters公司Delta 600E高效液相色譜儀；C18反相柱為Waters公司Symmetry 300 C18色譜柱, 規(guī)格5 μm, 250 mm×4.6 mm；LABCONCO公司FREEZONE PLUS 12冷凍干燥機(jī)；美國(guó)Thermo公司LCQ DECA XP高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MS)；日本JASCO公司J-810圓二色譜儀；美國(guó)Accelry公司insight II分子模擬軟件；成都泰盟科技有限責(zé)任公司BL-420E生物機(jī)能系統(tǒng)和神經(jīng)屏蔽盒。

1.4 芋螺毒素lt3a和lt3a[P6O]的固相合成

參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[14]，稱取0.1 mmol的樹脂，裝入合成柱中，加入2-3 mL的w=20%哌啶/DMF脫去Fmoc保護(hù)。分別根據(jù)lt3a和lt3a[P6O]的序列，按C端到N端順序，偶聯(lián)上第一個(gè)氨基酸，脫Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，活化下一個(gè)氨基酸并加入柱中，繼續(xù)去保護(hù)、活化，偶聯(lián)，直到偶聯(lián)上最后一個(gè)氨基酸，脫Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，加入2-3 mL裂解液至肽樹脂，將合成的粗肽裂解下來(lái)，并用預(yù)冷的10倍體積乙醚沉淀和洗滌粗肽約5次，凍干備用。

1.5 lt3a和lt3a[P6O]氧化折疊比較

采用GSSG/GSH法進(jìn)行多肽的氧化折疊，將精確稱量的多肽固體，用小量體積的超純水溶解后，加入到GSSG/GSH氧化溶液中，使終濃度為0.3 mg/mL。在室溫下用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，在所選時(shí)間點(diǎn)取樣加入φ=0.8%的甲酸終止反應(yīng)。并將多肽凍干濃縮體積，將凍干后的多肽用適當(dāng)體積的φ=0.1%三氟乙酸溶解后直接上Waters公司的Symmetry 300 C18反相柱 (30 nm, 5 μm, 4.6 mm ×250 mm) 進(jìn)行檢測(cè)。線性梯度洗脫，程序如表1所示，同時(shí)檢測(cè)215 nm和280 nm吸收峰，使用儀器自帶分析軟件進(jìn)行譜圖處理，根據(jù)保留時(shí)間和峰值判斷多肽的氧化折疊情況。

表1 反相高效液相色譜洗脫梯度
Table 1 Gradient of reverse-phase HPLC

時(shí)間/min流速/(mL·min-1)A/﹪B/﹪曲線﹡1.0955﹡201.05956

A:φ=0.1%三氟乙酸;B: 乙腈

A:φ=0.1%TFA;B: Acetonitrile

1.6 多肽的質(zhì)譜鑒定

多肽的質(zhì)譜鑒定參照文獻(xiàn)[15]所述方法進(jìn)行，在中山大學(xué)測(cè)試中心的LC/MS上進(jìn)行，直接將HPLC收集的目標(biāo)峰取5 μL進(jìn)樣，在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.7 lt3a和lt3a[P6O]的熱穩(wěn)定性比較

精確稱量純化好的lt3a和lt3a[P6O]，配成終濃度為100 μmol/L的多肽溶液，在空氣浴加熱儀上100 ℃分別加熱0.5、1、2、4和8 h。待冷卻到室溫后進(jìn)行HPLC分析。

1.8 lt3a和lt3a[P6O]結(jié)構(gòu)分析

lt3a和lt3a[P6O]圓二色光譜分析參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[16]：使用圓二色譜儀在25 ℃下測(cè)定遠(yuǎn)紅外190-260 nm的光譜。測(cè)定樣品的濃度為100 μmol/L，樣品杯光徑0.1 cm。分辨率0.5 nm，帶寬1 nm，靈敏度50 mdeg，速度50 nm/s，數(shù)據(jù)用Origin6.0進(jìn)行作圖。

多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬：使用分子模擬軟件insightII (Accelry, USA)對(duì)這兩個(gè)多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)的模擬。通過(guò)對(duì)lt3a序列的比對(duì)，根據(jù)M超家族內(nèi)第3個(gè)環(huán)內(nèi)氨基酸的數(shù)目分類方式，lt3a屬于m-1家族。而之前的研究顯示，m-1家族通常是1-5，2-4，3-6的二硫鍵連接方式。所以模擬采用m-1家族的連接方式形成二硫鍵。模擬條件設(shè)定：結(jié)構(gòu)優(yōu)化選擇conjugate收斂方式，設(shè)置R值為0.001，每次計(jì)算1 000次。優(yōu)化結(jié)構(gòu)直到能量達(dá)到最低，構(gòu)象不再變化為止，模擬出來(lái)的結(jié)構(gòu)用pymol 軟件進(jìn)行顯示。

1.9 lt3a和lt3a[P6O]對(duì)神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的影響比較

按照生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法制備蛙坐骨神經(jīng)干標(biāo)本: 蛙(蟾蜍)毀腦脊髓，去上肢和內(nèi)臟，下肢剝皮浸于任氏液中，分離出坐骨神經(jīng)，室溫條件下將制備好的神經(jīng)標(biāo)本縱向放于神經(jīng)屏蔽盒的電極上，接好刺激電極和記錄電極。神經(jīng)干應(yīng)與每個(gè)電極密切接觸。盒內(nèi)注入少量任氏液，蓋上盒蓋，使神經(jīng)盒封閉，防止神經(jīng)干燥。進(jìn)入BL-420E工作界面，選擇實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目-肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)-神經(jīng)干興奮傳導(dǎo)速度測(cè)定。引導(dǎo)、記錄及觀察蟾蜍坐骨神經(jīng)干的復(fù)合動(dòng)作電位:待引導(dǎo)出的復(fù)合動(dòng)作電位較穩(wěn)定后，將一小團(tuán)加藥棉花貼附在刺激電極和記錄電極中間的神經(jīng)上，間隔不同的時(shí)間進(jìn)行記錄和觀察復(fù)合動(dòng)作電位的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 lt3a與lt3a[P6O]的固相化學(xué)合成

為了研究羥脯氨酸的功能，首先應(yīng)用固相化學(xué)合成的方法合成了沒(méi)有羥基化修飾的多肽lt3a和第6位上為羥脯氨酸的多肽lt3[P6O]，經(jīng)過(guò) RP-HPLC純化后，進(jìn)行氧化折疊，并對(duì)合成的多肽進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，lt3a預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為1 859.5，質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果為1 859.3，lt3a[P6O]預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為1 875.5，質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果為1 877(938.5為二價(jià)離子峰)，合成的多肽均與預(yù)期相符。

圖1 lt3a和lt3a[P6O]合成多肽的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of synthetic peptides lt3a and lt3a[P6O]

2.2 lt3a與lt3a[P6O]的氧化折疊比較

羥脯氨酸在膠原及某些芋螺毒素中具有促進(jìn)蛋白或多肽進(jìn)行正確折疊的功能，本研究試圖通過(guò)比較lt3a和lt3a[P6O]氧化折疊的差異，以驗(yàn)證羥脯氨酸對(duì)毒素體外氧化折疊時(shí)形成正確構(gòu)象的影響。尚未氧化折疊的lt3a和lt3a[P6O]在氧化/還原型的谷胱甘肽溶液中進(jìn)行折疊反應(yīng)，分別取不同時(shí)間點(diǎn)用甲酸終止后進(jìn)行反相HPLC檢測(cè)。得到的譜圖如圖2所示，通過(guò)Empower軟件對(duì)目的峰進(jìn)行積分，計(jì)算出各時(shí)間點(diǎn)的正確折疊產(chǎn)物的得率，作出時(shí)間-得率圖如圖3所示。從圖2和圖3中l(wèi)t3a和lt3a[P6O]的氧化折疊比較發(fā)現(xiàn)，lt3a[P6O]在90 min時(shí)就達(dá)到了氧化折疊的終點(diǎn)，而lt3a在120 min以后才到了氧化折疊的終點(diǎn)。由表2可知，lt3a[P6O]和lt3a的折疊終產(chǎn)率分別為39.9%和40.6，沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明Hyp對(duì)氧化的終產(chǎn)率沒(méi)有太大的影響，這可能跟lt3a本身就具有較高的氧化折疊效率有關(guān)。但是lt3a[P6O]的氧化折疊速率是lt3a的兩倍。說(shuō)明Hyp的存在提高了折疊速率，使lt3a[P6O]更早地達(dá)到氧化終點(diǎn)。

表2 lt3a和lt3a[P6O]的最終得率和折疊速率Table 2 Folding product and kinetics of lt3a and lt3a[P6O]

圖2 lt3a和lt3a[P6O]不同氧化折疊時(shí)間的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of lt3a and lt3a[P6O] in different oxidative folding time

圖3 lt3a和lt3a[P6O]氧化折疊速率比較圖Fig.3 Folding kinetics of conotoxins lt3a and lt3a[P6O]

2.3 lt3a和lt3a[P6O]的結(jié)構(gòu)比較

首先對(duì)合成的多肽lt3a和lt3a[P6O]進(jìn)行圓二色譜的測(cè)定，圖4的結(jié)果表明, lt3a和lt3a[P6O]的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β結(jié)構(gòu)組成， 含有部分自由卷曲，沒(méi)有α-螺旋結(jié)構(gòu)，兩種多肽的圓二色譜圖極其相似，都在201 nm處有一個(gè)特征吸收峰。這說(shuō)明羥化脯氨酸的存在對(duì)lt3a的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的影響。

圖4 lt3a和lt3a[P6O]的圓二色譜圖Fig.4 Far uv of circular dichroism spectra of lt3a and lt3a[P6O]

圖5 lt3a和lt3a[P6O]的分子結(jié)構(gòu)模擬Fig.5 The molecular structure simulation of lt3a and lt3a[P6O]

進(jìn)一步的應(yīng)用模擬軟件insightII對(duì)lt3a和lt3a[P6O]進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果表明結(jié)果lt3a[P6O]與lt3a的三級(jí)結(jié)構(gòu)類似(見(jiàn)圖5)，lt3a[P6O]在C端形成一個(gè)大的略扭曲的Loop環(huán)。羥脯氨酸的存在沒(méi)有對(duì)lt3a整體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響。

2.4 lt3a和lt3a[P6O]的熱穩(wěn)定性比較

合成并純化后的lt3a和lt3a[P6O]在100 ℃的空氣浴中處理不同時(shí)間后，用HPLC檢測(cè)毒素的降解情況，應(yīng)用Empower軟件對(duì)峰面積進(jìn)行積分后，計(jì)算出不同處理時(shí)間點(diǎn)的未降解毒素比率，作出時(shí)間和未降解毒素的曲線圖，結(jié)果如圖6所示。芋螺毒素lt3a[P6O]的降解速度略快于lt3a，兩者在100 ℃下經(jīng)過(guò)8 h的解熱，都發(fā)生了完全的降解。說(shuō)明Hyp對(duì)熱穩(wěn)定性影響不大。

圖6 lt3a和lt3a[P6O]熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of thermal stability between lt3a and lt3a[P6O]

2.5 lt3a和lt3a[P6O]對(duì)神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的作用比較

本實(shí)驗(yàn)分別在兩種濃度下測(cè)定了lt3a和lt3a[P6O]對(duì)神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的抑制活性。由圖7的結(jié)果知，在低濃度(0.25 mmol/L)下，lt3a與其羥化脯氨酸異構(gòu)體lt3a[P6O]具有相同的動(dòng)作電位抑制活性，在高濃度下(2.5 mmol/L)，用藥后前15 min內(nèi)，lt3a起效更快，用藥20 min時(shí)，兩者達(dá)到相同的抑制活性，該結(jié)果說(shuō)明Hyp的存在對(duì)毒素的活性影響不大。

圖7 lt3a和lt3a[P6O]對(duì)神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的作用Fig.7 The effect of lt3a and lt3a[P6O] on compound action potential of nerve trunk

3 討 論

羥脯氨酸是哺乳動(dòng)物中常見(jiàn)的一種經(jīng)翻譯后修飾的氨基酸，由脯氨酸經(jīng)脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase)催化生成，一般羥化發(fā)生在4位上。這種氨基酸在哺乳動(dòng)物的膠原蛋白、補(bǔ)體成分C1q和乙酰膽堿酯酶(AChE)等蛋白中廣泛存在[17]。在非脊椎動(dòng)物線蟲的微膠原蛋白(minicollagen)[18]以及芋螺的毒素多肽中也有發(fā)現(xiàn)。羥化脯氨酸在膠原蛋白中的功能已經(jīng)得到了闡明[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白中脯氨酸選擇性的羥化是蛋白合成后的分泌以及三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)的形成所必需的。在本研究中我們通過(guò)合成羥脯氨酸的取代物，驗(yàn)證了羥脯氨酸能夠幫助芋螺毒素的體外折疊，其原因推測(cè)可能是由于脯氨酸肽鍵和羥脯氨酸肽鍵在溶液中具有不同的順?lè)串悩?gòu)(cis-trans isomerizaiton)轉(zhuǎn)換率有關(guān)[22]。正常肽鍵反式構(gòu)象的能量比順式構(gòu)象的能量低約2.5×4.184 J/mol，所以自然狀態(tài)下的肽鍵絕大多數(shù)采取的是反式構(gòu)象，順式肽鍵在蛋白中很少見(jiàn)。但是脯氨酸肽鍵的反式構(gòu)象能量?jī)H比順式構(gòu)象低約0.5×4.184 J/mol，且順?lè)串悩?gòu)的能量壁壘是13×4.184 J/mol，而正常肽鍵的能量壁壘為20×4.184 J/mol[23]。脯氨酸肽鍵在適當(dāng)條件下可以克服這個(gè)能量壁壘進(jìn)行構(gòu)象轉(zhuǎn)換。而且羥脯氨酸的存在使多肽的構(gòu)象更快到達(dá)平衡狀態(tài)，從而加快了折疊的效率。

雖然脯氨酸的羥化修飾可能會(huì)帶來(lái)體外折疊效率的提高，但在體內(nèi)是否也有相同的作用以及是否需要用這種修飾來(lái)促進(jìn)毒素折疊還不得而知。不過(guò)脯氨基-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase, P4H)的一個(gè)亞基與蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)高度同源[18]，有可能在體內(nèi)也會(huì)對(duì)毒素多肽的折疊產(chǎn)生一定的影響。然而目前還沒(méi)有研究表明P4H具有體內(nèi)催化多肽氧化折疊的作用。

對(duì)lt3a和lt3a[P6O]熱穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，羥脯氨酸的存在沒(méi)有增加芋螺毒素lt3a的熱穩(wěn)定性，而哺乳動(dòng)物中膠原蛋白則可以提高其熱穩(wěn)定性，此外，圓二色譜的結(jié)果顯示lt3a和lt3a[P6O]都沒(méi)有α螺旋，這可能解釋了羥脯氨酸在芋螺毒素中沒(méi)有增加熱穩(wěn)定性的原因，是與lt3a沒(méi)有螺旋結(jié)構(gòu)以及足夠多的Hyp有關(guān)。膠原蛋白具有穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)，而羥脯氨酸如星羅點(diǎn)綴于其間，羥基伸向螺旋外側(cè)吸引著水分子，與水分子形成“水橋”，氫鍵的形成大大提高了膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。芋螺毒素和膠原蛋白的結(jié)構(gòu)完全不同，所以羥脯氨酸在它們之中的作用也大有差異。同時(shí)，羥脯氨酸對(duì)lt3a的活性似乎也沒(méi)有太大的影響，從組織水平上的實(shí)驗(yàn)看來(lái)，lt3a和lt3a[P6O]具有相同的抑制動(dòng)作電位的活性?？赡苁橇u脯氨酸的氫鍵和受體分子沒(méi)有相互作用，所以不影響毒素的活性。