劉宏，蘇薇薇，彭維，姚宏亮

(中山大學生命科學學院∥廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心，廣東 廣州510275)

中藥譜效學研究是近年來中藥研究的一個熱點。譜效學能夠準確反映中藥的藥效物質基礎，它為中藥質量控制、組方科學解析等提供了依據(jù)[1-6]。我們在進行中藥譜效學研究過程中，需尋找中藥化學成分差異與藥效差異的對應關系，因此構建原料藥材配比不同的系列差異樣品很有必要；這在國內尚處于發(fā)軔階段。我們提出一種中藥譜效學研究過程中差異樣品的構建方法，現(xiàn)報道如下。

1 差異樣品構建的基本思路與方法

差異樣品構建的基本思路：當中藥有效成分群發(fā)生變化時，其藥效也會隨之發(fā)生改變。當某一成分的含量發(fā)生顯著變化，而對應的生物活性并無顯著改變，則表明該成分與藥效關聯(lián)性弱；反之，則表明該成分與藥效關聯(lián)性強。因此，在構建的差異樣品中，各化學成分的變化十分重要?；瘜W成分來源于藥材，而復方中藥又是由多味藥材組成，通過對各味藥材進行調整能夠達到構建差異樣品的目的。實際應用中，復方中藥涉及到不同的藥材以及各味藥材的多個投料水平，是典型的多因素、多水平試驗設計，均勻設計方法的使用則可大大降低試驗次數(shù)并反映差異樣品間的差異性。

基于上述思路，我們提出一種中藥譜效學研究過程中差異樣品的構建方法，具體如下：① 將各味組成藥材單獨視作試驗因素；② 根據(jù)原組方比例確定各味藥材的投料量變化范圍；③ 在該范圍內確定合適的水平數(shù)；④ 采用均勻設計方法，根據(jù)因素數(shù)、水平數(shù)選擇合適的均勻設計表進行藥材及其投料量的均勻排布；⑤ 按照標準工藝流程制備多組差異樣品并進行其指紋圖譜監(jiān)測，采用聚類分析方法驗證差異樣品間的差異性。

2 差異樣品構建的具體實施

我們以復方血栓通膠囊為例說明具體實施過程。復方血栓通膠囊由三七、丹參、黃芪、玄參組成，方中重用三七之活血化瘀為君藥，丹參為臣藥，破瘀血、補新生血，黃芪之補氣升陽與玄參之滋陰涼血合用治療氣陰兩虛為佐藥。長期大量的醫(yī)療實踐和臨床應用證實，復方血栓通膠囊對眼底及心腦血管疾病療效顯著。復方血栓通膠囊差異樣品的構建步驟如下：

2.1 材料

(1) 儀器、試劑：數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，KQ-250DE)，渦旋振蕩器(Scientific Industries Vortex-Genie 2)，旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-5205/RE-2000B)，烘箱(Millipore，UFB400)，超純水器(Millipore Simplicity)，電子分析天平(Sartorius)，冰箱(Siemens)，燒杯、錐形瓶、蒸餾瓶等玻璃儀器；甲醇、乙腈、磷酸(色譜純)，超純水。

(2) 藥材：三七，批號：161110；丹參，批號：161110；黃芪，批號：161110；玄參，批號：161110，由廣東眾生藥業(yè)股份有限公司提供。

2.2 方法

(1) 三七、丹參、黃芪、玄參投料設計

復方血栓通膠囊的原組方比例中三七、丹參、黃芪、玄參所占比例分別為54%、10%、18%、18%。在均勻設計時，丹參在0%-20%間均勻變化，黃芪在0%-36%間均勻變化，玄參在0%-36%間均勻變化，君藥三七在33.2%-74.8%間均勻變化。根據(jù)四因素十一水平均勻設計表進行投料，見表1。

(2) 差異樣品的制備

根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版復方血栓通膠囊標準工藝流程[7]，按表1進行藥材投料：三七粉碎后用φ=50%乙醇浸漬提取2次，浸漬液濾過，濾液合并，回收乙醇并濃縮成浸膏；丹參、黃芪、玄參三味藥材，用φ=50%乙醇加熱回流提取2次，提取液濾過，濾液合并，回收乙醇并濃縮成浸膏；將上述兩份浸膏混合，即得。

表1 復方血栓通膠囊差異樣品的藥材投料量及其比例Table 1 Herb proportions in Compound Xueshuantong Capsule (CXC) samples

(3) 差異樣品的指紋圖譜監(jiān)測[8-9]

儀器與試劑：Dionex Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀，Dionex Acclaim?120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)，乙腈、磷酸(色譜純)，超純水。

供試品制備：取11組差異樣品各約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加φ=70%甲醇20 mL，密塞，超聲處理60 min，濾過，取濾液，減壓回收溶劑至近干， 加φ=50%甲醇使溶解，定量轉移至10 mL量瓶，加φ=50%甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

液相色譜條件：流動相A乙腈(0-50 min，15%→34%)，流動相Bw=0.05%磷酸溶液(50-59 min，34%→75%)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長203 nm、270 nm。

2.3 結果

指紋圖譜及其聚類分析結果：11組差異樣品的色譜圖見圖1。根據(jù)20個共有峰峰面積，將其導入SPSS 21.0中對差異樣品S1-S11進行聚類，聚類方法為Between-groups linkage，距離計算方法采用Minkowski。如圖2所示，當Rescaled Distance Cluster Combine為4時，差異樣品可分為8類，存在明顯的化學成分含量差異。

圖1 復方血栓通膠囊差異樣品HPLC色譜圖(A:203 nm；B:270 nm)Fig.1 HPLC chromatogram of CXC samples (A: 203 nm; B: 270 nm)

圖2 復方血栓通膠囊差異樣品聚類分析結果Fig.2 Cluster analysis of CXC samples

3 討 論

由兩味藥材組成的復方中藥品種，藥材及成分組成相對簡單，可直接通過對藥材進行均勻配比的方法制備差異樣品。當組方藥材增加到三味及以上時，通過簡單的藥材均勻加減進行調配不再適用，一方面是由于很難滿足各味藥材的投料比的總和為100%，另一方面所構建的差異樣品在全部藥材組合下的空間分布不均勻，無法體現(xiàn)出差異性。在這種情況下，可考慮應用均勻設計思想指導各味藥材的投料比例。

在差異樣品的均勻設計中，因素數(shù)、水平數(shù)、投料變化范圍的確定十分重要。當組方由三至六味藥材組成時，因素數(shù)可直接由各味藥材確定；水平數(shù)的確定，一方面考慮到為后續(xù)的差異樣品化學信息與藥效信息相關提供充足的樣品保證，另一方面需考慮試驗次數(shù)的增加帶來的工作難度，一般考慮9-11水平，即構建9-11組差異樣品為宜。

投料變化范圍的確定，要考慮中藥組方中的“君臣佐使”方解，在實際應用中，“君”藥在整個組方中具有十分重要的地位，其投料范圍在一定范圍內調整但不能缺失，而“臣”、“佐”、“使”藥可根據(jù)需要設置缺失；上述三個參數(shù)的設定原則在應用實例復方血栓通膠囊的差異樣品構建中均有體現(xiàn)。

當組方由六味及以上的藥材組成時，若因素數(shù)直接由藥材數(shù)量確定，均勻設計試驗的水平數(shù)至少要在12水平以上，保證較好的均勻度則需更進一步增加水平數(shù)，大大增加了工作量與難度。因此，建議根據(jù)藥材的化學性質或傳統(tǒng)方解中的君臣佐使，先把所有藥材分為三至六類，再進一步構建所需差異樣品。

應用實例中，我們介紹了復方血栓通膠囊具有化學成分差異的樣品構建過程，這些差異樣品在藥效上是具有明顯差異的[2]。

近年來，我們還完成了腦栓通膠囊[10]、參芪扶正注射液[11]、丹紅注射液[12]、口炎清顆粒[13]等中藥品種差異樣品的構建及其藥效、機理、譜效關聯(lián)研究。上述實踐與應用經驗表明：本文提出的方法不同于以往的化學成分逐一分離、再組合的方式，而是在尊重原組方藥材比例的基礎上從整體對復方中藥的藥材進行重新調整、組合，具有實現(xiàn)難度小、適用性高的優(yōu)點，符合中藥的混合性、整體性、統(tǒng)一性特點。