郭艷紅 鐘惠敏 周龍書

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510000)

卵巢癌是一種惡性程度高、治療難度大的婦科腫瘤。受卵巢在體內(nèi)所處的位置及卵巢癌的生物學(xué)特性的影響，卵巢癌的早期診斷比較困難[1]。因而，尋找卵巢癌早期發(fā)病的相關(guān)指標(biāo)，對疾病的早期診治及患者的預(yù)后有著積極意義。新近發(fā)現(xiàn)，clusterin和septin-9蛋白可能與卵巢癌的發(fā)病存在一定的相關(guān)性。其中，clusterin蛋白是一種抗凋亡蛋白，在多種器官和組織中均有表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)，clusterin蛋白的高表達(dá)與肺癌、乳腺癌等有關(guān)[2]。編碼septin-9蛋白的septin-9基因位于染色體17q25.3，亦被稱之為ovarian/breast(Ov/Br)septin基因，目前認(rèn)為其發(fā)揮了原癌基因的作用[3]。CA125是一項(xiàng)臨床常用的腫瘤指標(biāo)，對消化系統(tǒng)及婦科等腫瘤具有較高的敏感性。筆者擬在傳統(tǒng)腫瘤指標(biāo)CA125基礎(chǔ)上聯(lián)合clusterin和septin-9基因/蛋白的檢測，以分析其與卵巢癌患者早期診斷及預(yù)后判斷的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇我院婦產(chǎn)科2016年5月至2018年1月收治的明確診斷為卵巢癌的患者62例為觀察組。另選擇同期健康體檢者31例為對照組。觀察組年齡35～48歲，平均(41.25±6.28)歲；FIGO分級Ⅰ～Ⅱ期的患者共33例；Ⅲ～Ⅳ期的患者29例；其中未分化者5例，低分化者28例，中分化者10例，高分化者19例；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者22例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者40例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例。對照組年齡35～49歲，平均(41.62±6.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理證實(shí)為卵巢癌并采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分期；未接受化療、放療及生物治療等；預(yù)計(jì)生存期≥6個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：卵巢轉(zhuǎn)移性癌；合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。兩組患者基線資料間未見明顯差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑與方法

1.2.1試驗(yàn)試劑及儀器 試劑：Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)、RNA提取試劑盒(購自德國Miltenyi Biotec公司)、逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒(均購自美國 Invitrogen 公司)、引物合成(上海生工公司)、人clusterin ELISA試劑盒(購自美國LIFEKEY公司)、人septin-9 ELISA試劑盒(購自美國ABNOVA公司)、CA125采用化學(xué)發(fā)光法檢測。儀器：ABI 7300型實(shí)時定量熒光PCR儀。

1.2.2方法 (1)抽取患者外周血于4℃條件下，1 500 g離心力下離心15 min，取上層血漿分裝保存于-80℃冰箱以備用。(2)采用qRT-PCR方法檢測基因表達(dá)水平采用TRIZOL試劑提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以β-catin為內(nèi)參基因，采用ABI 7 300型PCR儀將轉(zhuǎn)錄成的cDNA在50℃、2 min，95℃、15 min，95℃、15 s，60℃、1 min，共40個循環(huán)條件下擴(kuò)增。每次循環(huán)均設(shè)空白對照，計(jì)算目的基因 mRNA的相對表達(dá)量，每組重復(fù) 3 次取均值。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析并鑒定。基因相對表達(dá)量采用△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-catin)觀察組-(Ct目的基因-Ctβ-catin)對照組，觀察組標(biāo)本相對表達(dá)量為2-△△Ct。引物序列見表1。(3)按照ELISA試劑盒說明書，分別檢測血漿中clusterin和septin-9蛋白水平。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組患者clusterin和septin-9 mRNA表達(dá)水平比較 經(jīng)過檢測顯示，觀察組患者外周血中clusterin和septin-9 mRNA相對表達(dá)量分別為(1.67±0.81)、(1.93±0.22)；外周血中clusterin和septin-9 蛋白相對表達(dá)量分別為(133.26±16.31)、(633.29±28.61)。與對照組相比，觀察組患者外周血中clusterin和septin-9 Mrna/蛋白表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組患者外周血CA125表達(dá)水平比較 與對照組(37.91±11.84) kU/mL相比，觀察組患者外周血中CA125表達(dá)量(279.36±36.14) kU/mL顯著升高(t=5.338，P=0.011<0.05)。

2.3外周血clusterin、septin-9及CA125表達(dá)水平與疾病相關(guān)性 分別比較不同病理分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)及不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者與Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者相比，clusterin基因/蛋白及CA125水平顯著降低(P<0.05)，而septin-9基因/蛋白表達(dá)水平間未見明顯差異；未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)者較發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)者，其septin-9基因/蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而clusterin基因/蛋白及CA125間未見明顯差異；不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達(dá)水平均未見明顯差異。見表2。

表2 不同病理分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達(dá)水平差異

3 討 論

卵巢癌是婦女第五常見的惡性腫瘤。卵巢惡性腫瘤死亡率居高不下的原因主要在于約占卵巢原發(fā)惡性腫瘤總數(shù)80%～90%的卵巢上皮性癌在早期時癥狀不明顯，沒有有效的早期篩查手段，臨床上早期難以發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時常常已經(jīng)是晚期，而晚期卵巢癌即使經(jīng)過規(guī)范化治療，在治療后3年內(nèi)多數(shù)仍會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥，患者預(yù)后很差，5年生存率僅為20%左右[4-6]。因此，尋找早期的診斷指標(biāo)對卵巢癌患者的診斷、治療及遠(yuǎn)期預(yù)后具有重要意義。傳統(tǒng)的腫瘤指標(biāo)主要包括糖類蛋白等，其中CA125對消化系統(tǒng)及婦科系統(tǒng)來源腫瘤具有較高的他特異性，但在疾病早期缺乏敏感。相關(guān)指標(biāo)明顯升高時，往往原發(fā)病已顯著進(jìn)展。因而，單純依靠現(xiàn)有的腫瘤監(jiān)測指標(biāo)遠(yuǎn)不能滿足包括卵巢癌在內(nèi)的惡性腫瘤性疾病的診治需求。

septin-9定位于染色體17q25.3，是體內(nèi)重要的原癌基因之一[7]。體外研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，在人細(xì)胞系的AffymetrixHG U133基因芯片檢測結(jié)果表明，septin-9在乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮內(nèi)膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來源的腫瘤中高表達(dá)。clusterin基因定位于染色體8p21-p12，其編碼的蛋白參與了多種重要生理功能，包括精子成熟、膜再生、脂類轉(zhuǎn)運(yùn)、組織分化和重塑、補(bǔ)體抑制、細(xì)胞．細(xì)胞及細(xì)胞．細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、炎癥、細(xì)胞運(yùn)動、分子伴侶、細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等[10-15]。近年來研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，clusterin除作為胞外分子伴侶發(fā)揮使應(yīng)激性蛋白變穩(wěn)定的作用外，也是一種凋亡相關(guān)蛋白，參與到細(xì)胞程序化死亡過程中，該蛋白在腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到一定的促進(jìn)作用。然而有關(guān)septin-9/clusterin基因及其轉(zhuǎn)錄的蛋白水平與卵巢癌發(fā)生及進(jìn)展過程是否相關(guān)，相關(guān)報(bào)道較少。本組資料中，在觀察組患者中septin-9及clusterin基因/蛋白表達(dá)的水平較對照組顯著升高，提示這兩種基因/蛋白可能參與了卵巢癌發(fā)病過程，在進(jìn)一步的分析中發(fā)現(xiàn)，病理分期晚期的患者中，其clusterin基因/蛋白及CA125表達(dá)水平較早期患者顯著升高，提示clusterin聯(lián)合CA125檢測對早期卵巢癌的診斷具有一定的意義。而通過對原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移情況分析發(fā)現(xiàn)，septin-9基因/蛋白在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中明顯升高，這表明septin-9的高表達(dá)可協(xié)助提供腫瘤進(jìn)展的證據(jù)。

綜上所述，卵巢癌患者外周血中clusterin、septin-9及CA125水平較正常人群均顯著升高，其中clusterin和CA125表達(dá)增高者可能提示病理分期較高，septin-9表達(dá)增高考慮存在原發(fā)病的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能。然而，受到樣本量等客觀因素的限制，數(shù)據(jù)偏倚在所難免，相關(guān)因素的長期作用尚需進(jìn)一步研究。