丁小芹 汪秋春 曾火明 何愛軍

(湖北省孝感市中醫(yī)醫(yī)院兒科，湖北 孝感 432000)

病毒性心肌炎(viralmyocarditis，VMC)是患者心肌被嗜心性病毒感染，致使心肌或者其相關間質的彌漫性或局灶性炎癥[1]。并以單核-巨嗜細胞及心肌間質淋巴細胞浸潤為主要的病理學特征，同時伴有一定程度的鄰近心肌細胞壞死或變性，是小兒心血管科較為常見的一種心血管疾病[2]。由于VMC沒有典型的臨床特征，通常難以引起人們的關注，當患兒的心臟傳導阻滯被感染波及時，可造成患者驟然死亡[3]。研究[4]顯示，嬰幼兒VMC患者的病死率高達50%左右，且兒童VMC患者的預后相對較差，瑞典衛(wèi)生機構的調查顯示，VMC疾病的猝死比例已經占有10%左右，嚴重危及患兒的健康及預后生活質量。而NF-κB是一種基因轉錄調節(jié)的關鍵性因子，參與炎癥反應相關的基因應答及機體防御功能的調控，與VMC患兒的病情關系密切[5]。故本文探討VMC患兒外周血中NF-κB表達量的變化及其與病情的相關性，為VMC患兒的臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇我院2016年3月至2018年3月收治的VMC患兒106例作為研究對象，根據(jù)病情將其分為休克組、心衰組和無心衰組，并取同期我院門診外科32例患兒作為對照組。其中對照組患兒的心電圖、胸透以及血象較為正常，且近期無感染，其中男18例，女14例，年齡1～12歲，平均(7.26±3.04)歲。休克組15例，其中男8例，女7例，年齡1～13歲，平均(6.87±3.12)歲；心衰組28例，其中男16例，女12例，年齡1～13歲，平均(6.76±3.21)歲；無心衰組63例，其中男34例，女29例，年齡1～12歲，平均(6.94±3.32)歲。診斷標準：參考1999年全國心肌病以及小兒心肌炎學術會議制定的《小兒病毒性心肌炎診斷標準》[6]，具體如下：(1)臨床診斷依據(jù)：心臟擴大；心臟綜合征、心源性休克及心功能不全；心肌肌鈣蛋白或者CK-MB陽性；以R波為主的ST-T持續(xù)性改變并伴有動態(tài)變化，房室、竇房傳導阻滯，完全左束或右束支傳導阻滯，呈現(xiàn)成對、多源、多型、成聯(lián)律。異常Q波及低電壓。(2)病原學診斷依據(jù)：患兒血液中探查到病毒核酸；早期有特異性IgM抗體陽性出現(xiàn)；血壓、糞便中分離到病毒，與第1份血清相比，恢復期血清降低4倍以上或者一定程度升高。確認指標，可將病毒自心包、心肌、心內膜或者心包穿刺液中分離出來；特異性病毒抗體呈陽性；患兒血液中探查到病毒核酸。(3)判斷標準：至少具有2項以上的臨床診斷依據(jù)，且有一定的病毒感染支持，同時具有1項病原學參考依據(jù)，即可診斷。納入標準：(1)符合上述診斷標準者；(2)首次患病，且年齡≤14歲；(3)此研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準；(4)家屬簽署知情協(xié)議書。排除標準：(1)伴有先天性心臟病者；(2)伴有急性傳染性疾病；(3)伴有嚴重的肝腎功能障礙者；(4)臨床資料不完整；(5)依從性差，中途退出者。分組標準：文中根據(jù)患者的臨床體征及癥狀，將VMC患者分為休克組、心衰組和非心衰組。其中休克組：患兒通常驟然起病，呈現(xiàn)爆發(fā)性經過，并以無尿、收縮壓60～80 mmHg、舒張壓0～40 mmHg、肢體發(fā)涼、皮膚濕冷、奔馬律、脈搏細速、面色蒼白等為主要休克表現(xiàn)，動態(tài)心電圖往往出現(xiàn)心動過緩、室顫、完全性房室傳導阻滯，超聲檢查心功能明顯下降。心衰組：參考第7版《實用兒科學》[7]中相關規(guī)定，存在少尿、雙下肢浮腫、肝臟增大、奔馬律、呼吸心率增快、循環(huán)充血、無其他誘因的煩躁，超聲顯示為心包積液以及心臟擴大等改變，X線顯示心博減弱，胸片顯示患者心影擴大，動態(tài)心電圖顯示患者存在較為嚴重的心律失常，同時伴有一定程度的傳導系統(tǒng)以及其他系統(tǒng)損傷。(3)無心衰組：存在短陣房速、結性早搏、室早、房早、心電圖ST-T波改變、較輕病癥或者其他非特異性癥狀，另外還具有一定的心動過速、精神不好，多數(shù)患兒在數(shù)周或者數(shù)日內即可痊愈。

1.2方法

1.2.1心功能指標測定 在所有患兒入院24 h內，由同一專門的經驗豐富的影像科醫(yī)師，采用彩色多普勒超聲診斷儀(ACUSON S2000；德國西門子)對患者的射血分數(shù)(EF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左房內徑(LAD)及左室收縮末期內徑(LVESD)進行測定。

1.2.2血清心肌酶譜測定 于患兒入院次日清晨8～10時，抽取其5 mL的空腹靜脈血，通過離心機(Ortho BioVue；強生(上海)醫(yī)療器材有限公司)在離心半徑為10.5 cm、轉速3 000 r/min條件下，離心10 min，取其上清液，冰箱-75℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定患兒血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)水平，試劑盒購于北京丹大生物技術有限公司，操作方法嚴格按照說明書進行。

1.2.3外周血中NF-κB表達水平測定[8-9](1)單核細胞的標記：于患兒入院次日清晨8～10時，另抽取其5 mL的空腹靜脈血，加入肝素鈉進行抗凝處理；將2.5 mL經過PE-Cy5標記的鼠抗人CD14單抗(上海遠慕生物科技有限公司)加入到加樣管中，再將上述經過抗凝處理的100 μL血加入其中，振搖，進行20 min的避光反應。(2)單核細胞的固定：根據(jù)FIX&PERM試劑盒(聯(lián)科生物技術有限公司)中的有關說明，在加樣管中加入Fixation Medium A 100 μL進行固定處理，并在避光條件下進行15 min的反應，之后在加入PBS 2 mL，離心機在離心半徑為10.5 cm、轉速1 500 r/min條件下，離心5 min，棄去上清液。(3)單核細胞的破膜及免疫熒光抗體染色處理：根據(jù)上述試劑盒說明書操作規(guī)程，破膜處理需將Permeabilization Medium B 100 μL加入到加樣管中，之后在檢測管中加入5 μL NF-κB P65單抗(經PE標記)IgG同型免疫球蛋白單抗(安必奇生物科技有限公司)，在對照管中加入5 μL小鼠抗人NF-κB P65單抗(經PE標記)。振蕩搖勻，避光條件下，進行20 min的反應，將PBS 2 mL加入到其中，離心機在離心半徑為10.5 cm、轉速1 500 r/min條件下，離心5 min。棄去上清液，將500 μL的生理鹽水加入其中，充分振蕩均勻，最后采用上流式細胞儀(Gallio型；貝克曼庫爾特)對其NF-κB表達水平進行測定。

2 結 果

2.1不同病情患兒心功能指標比較 對于VMC患者，按照無心衰組、心衰組及休克組的等級分組順序，其EF異常率、LVFS異常率、LAD及LVESD值均明顯升高，且均明顯高于對照組(P<0.05)。

表1 不同病情患兒心功能指標比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2不同病情患兒血清心肌酶譜指標比較 對于VMC患者，按照無心衰組、心衰組及休克組的等級分組順序，其ALT、AST、LDH、cTnI、CK-MB及CK水平均明顯升高，且均明顯高于對照組(P<0.05)。

表2 不同病情患兒血清心肌酶譜指標比較

注：與對照組相比，#P<0.05。

2.3不同病情患者的外周血中NF-κB表達水平比較 對于VMC患者，按照無心衰組、心衰組及休克組的等級分組順序，其外周血中NF-κB表達水平明顯升高，且均明顯高于對照組(P<0.05)。

表3 不同病情患者的外周血中NF-κB表達水平比較

注：與對照組相比，△P<0.05。

2.4VMC患兒外周血中NF-κB表達水平與其病情分組等級相關性分析 VMC患兒外周血中NF-κB表達水平與VMC患者分組呈現(xiàn)等級正相關(r=0.641，P<0.05)。

3 討 論

VMC是一種臨床常見的兒科心血管疾病，也是新生兒患兒致死的主要原因之一，嚴重危及患兒的生命健康。由于VMC所引起的兒童心源性猝死率升高，逐漸受到醫(yī)護工作者的高度重視。目前臨床上對于其發(fā)病機制尚未有權威性解釋，但一般認為與病毒感染所致的免疫損傷及心肌損傷有關[10]。由于超聲心動圖可以對患者心腔功能及大小進行直觀的顯示，可以對心肌結構功能病變進行預測。其中EF和LVFS是對患者左心室收縮功能評價最為常用的指標；LVESD是反映其左室收縮功能及收縮末期大小的指標；LAD是一種可以判斷心臟擴大與否的重要指標[11]。本文中結果提示VMC患者容易累及其左室收縮功能，心臟擴大，收縮功能下降，按照無心衰組、心衰組及休克組的順序，其病情逐漸加重。另外，心肌酶譜指標是可以反映VMC患兒心肌損傷程度的指標，其中ALT、AST、LDH、cTnI、CK-MB及CK是最為常見的幾種心肌酶譜指標，也可以相應地反映患者病情的嚴重程度[12]，文中結果提示VMC患者病情越重，其心肌損傷程度相對越重。

NF-κB是Baltimore和Sen于1986年發(fā)現(xiàn)的一種存在于人體各種細胞胞漿中的重要轉錄因子，同時也是諸如急性期反應蛋白、黏附因子、炎癥介質、生長因子、免疫受體、轉錄因子及促炎因子等高表達所必需的轉錄因子，在VMC疾病的發(fā)生及進展過程中作用顯著[13]。而正常情況下，NF-κB在人體靜止細胞的細胞質中以兩種無活性的狀態(tài)存在(與其前提p105或p100相結合；與IκB相結合)，在受到前炎癥因子等多種因素的誘導下，進行活化，誘導諸如因子的轉錄[14]。文中結果顯示，隨著VMC病情的加重，患兒外周血中NF-κB表達水平逐漸升高，兩者呈現(xiàn)等級正相關，故認為NF-κB是一種可以反映VMC患者病情嚴重程度的敏感指標。這可能是由于機體內部的細胞因子在VMC疾病病毒誘發(fā)、自身免疫反應以及病情進展過程中，具有一定的作用[15]。而NF-κB廣泛存在于患者細胞胞漿中，可以促進多種細胞因子的表達，調控VMC患者急性炎癥的發(fā)生及進展過程[16]。細胞中NF-κB在嗜心性病毒的感染誘導下，進入細胞核內部，對IL-1、TNF-α等原發(fā)性炎性介質基因的表達進行調控，從而進一步促進更多的繼發(fā)性細胞介質及因子被巨嗜細胞產生[17]?？傊琋F-κB主要是通過對酶類、化學因子、炎性因子以及粘附分子等細胞介質及因子的轉錄表達進行誘導影響而發(fā)揮作用[18]。反過來，大量促炎介質的表達也會進一步對NF-κB進行激活，進而形成級聯(lián)放大效應，加重病情的發(fā)展惡化[19]。而Z.Cheng等[20]通過對小鼠模型進行研究發(fā)現(xiàn)，INF-γ、TNF-α、IL-1等mRNA的表達水平升高，而TNF-α為心肌炎癥反應中較為重要的炎癥因子，可以對無活性的IκB進行降解，進而激活NF-κB，造成心肌損傷、凋亡甚至壞死，加重病情，也證實了本文的觀點。

綜上所述，VMC患兒外周血中NF-κB表達水平與VMC患兒分組呈現(xiàn)等級正相關，可以作為VMC患者病情程度判定的重要參考指標。