宋詩清， 童彥尊， 馮 濤*， 范然然， 喻 晨

（1．上海應用技術大學 香料香精技術與工程學院，上海市 201418；2.安琪酵母股份有限公司 特種酶制劑事業(yè)部，湖北省宜昌市443003）

犬糧誘食劑大都以蛋白質酶解液為底物進行美拉德反應獲得（易建華等，2016），因此許多針對誘食劑生產的商業(yè)復合蛋白酶面世，成為該領域研究的重點之一。風味的好壞是誘食劑產品的命脈，一款風味飽滿的誘食劑能極大改善狗糧的適口性。風味呈現(xiàn)并非由某一種或一類的化合物決定，而是相互作用的結果（Kerth等，2015）。在寵物食品方面，香氣提取主要采用HS-SPME（Chen等，2017）。電子鼻在食品領域中被廣泛運用，可區(qū)分不同產品的整體香氣差異或檢測同一種產品的貨架期（Rock等，2008）。電子鼻能將人對風味的捕捉數(shù)字化，結合感官評價使風味分析更具科學性。Tian等（2015）將電子鼻與GC-MS聯(lián)用對牛肉的品質及風味進行了分級和評價。

本試驗對三種不同的酶制得的誘食劑進行感官評定、氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）和氣相色譜-嗅辨儀（GC-O）分析，確定誘食劑的風味特征及關鍵風味成分。用電子鼻區(qū)分三種誘食劑的整體香氣差異。采用適口性測試驗證三種誘食劑的實際應用效果，體現(xiàn)三種誘食劑風味的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 誘食劑A、B、C采用不同酶解液做底物的誘食劑；犬糧：上海仕林生物科技有限公司提供；20只試驗犬（表1）：上海交大農學院教學實驗實習場；2-辛醇 （色譜純）、烷烴C5-C22（色譜純）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；二氯甲烷（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司。

表1 試驗犬信息

1.2 儀器與設備 7890A-5975C型GC-MS 7890A氣相色譜儀 （安捷倫科技有限公司）；ODP嗅聞裝置 （德國Gerstal公司）；FOX4000電子鼻（法國阿爾法莫斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 感官評價 選5名感官人員對誘食劑進行感官評定，標準如表2所示。

表2 感官評價標準

1.3.2 HS-SPME法萃取香氣 準確稱取4 g誘食劑，加入20 mL萃取瓶中，在50℃水浴溫度下平衡15 min，用老化好的萃取纖維頭（50/30μm纖維頭：DVB/CAR/PDMS）頂空萃取 40 min，萃取溫度為50℃。萃取纖維頭解吸5 min，解吸溫度為250℃。

1.3.3 GC-MS條件 GC條件：HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣 N2，流量為3 mL/min，不分流；進樣口溫度250℃；升溫程序：45℃保留1 min，以4℃/min升溫至230℃，保留15min。

MS條件：采用電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度250℃；采用全掃描方式；質量掃描范圍為m/z 20～350。

1.3.4 SDE法萃取香氣 用同時蒸餾裝置，取15 mL誘食劑和150 mL蒸餾水混合，溫度控制在100～200℃，用二氯甲烷作溶劑，加60mL，萃取3 h。萃取結束后收集提取液，加無水硫酸鈉，低溫陳化24 h，濃縮至1 mL，加入10μl內標物（0.2mg/ml2-辛醇）。 進樣量：0.2 μL，分流比 10∶1，溶劑延遲6min，升溫程序不變。

1.3.5 AEDA法分析 用二氯甲烷將濃縮液分別以 1∶3、1∶9、1∶27、1∶81，1∶243 比例稀釋，取 2 μL 稀釋后樣品注射到GC-O裝置（GC條件不變），直到評價人員在ODP末端不再嗅聞到氣味，記下此時的稀釋倍數(shù)，并計算FD因子 （Usami等，2013；Choi等，2010）。評價人員需記錄從ODP口聞到的氣味特性及時間，結果與香氣物質的出峰時間匹配，要求至少有兩名評價人員（共三人）描述一致。

1.3.6 電子鼻分析 分別稱取三種誘食劑各1 g到5mL的樣品瓶中，依次放于電子鼻的自動進樣器上。采樣時間900 s，采樣溫度60℃，進樣針量為2500μL，每個樣品重復4次。

1.3.7 適口性測試 犬糧制備：在55℃條件下將誘食劑均勻噴涂在犬糧表面（添加量5%），冷卻后得到誘食劑添加糧Aa、Bb和Cc，空白犬糧D作為對照。

動物試驗（Aldrich 等，2015）：先以 Aa和 Bb、Aa和Cc做兩組比對，選取效果較好的與D比較進行驗證；每組持續(xù)兩天，每天喂2餐（間隔7 h），選20只成年小型犬。每餐同時喂兩種犬糧各100 g，喂食持續(xù)30 min，記錄犬對犬糧的第一口偏好，喂食完畢再記錄剩余的犬糧；每次喂食前清潔并固定食具，準備飲用水，每餐需交換食具位置，犬糧不得重復飼喂；試驗犬須健康狀況良好，無嘔吐拉稀狀態(tài)。

1.3.8 計算公式 用NIST庫檢索出峰，通過烷烴C5-C22在相同條件下的保留時間，計算揮發(fā)性物質的保留指數(shù) （retention index，RI）（Majlát等，1974），將算得的 RI與Wiley 7n.l數(shù)據(jù)庫進行匹配，RI按公式（1）計算：

式中：tx為揮發(fā)性物質的保留時間，min；tz為與揮發(fā)性物質碳原子數(shù)相同的烷烴的保留時間，min；z為烷烴碳原子數(shù)。

香氣活力值（OAV）等于揮發(fā)性物質的濃度與水中的嗅覺閾值之間的比值。揮發(fā)性物質濃度按公式（2）計算：

式中：Wi為揮發(fā)性物質含量，μg/g；ms為內標物質量，μg；Ai為揮發(fā)性物質峰面積；As為內標物的峰面積；m0為濃縮物質量，g。

FD因子即Log3FD，F(xiàn)D為樣品的稀釋倍數(shù)，Log3FD≥3時證明香氣物質對香氣貢獻大（Buttery等，2013）。

采食率/%=消耗的犬糧/總犬糧×100。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 用SPSSStatistic 19進行方差分析，按Duncan的多范圍測試結果具有顯著性（P<0.05）。

采用Unscrambler 9.7進行PLSR分析動物試驗結果與香氣物質間的相關性，模型采用Full Cross-Validation進行校正。

2 結果與分析

2.1 感官評定與比較 三種誘食劑的感官評定結果如表3及圖1所示。三種誘食劑均有明顯的雞肉香氣，可能由于三款誘食劑都以雞肝作為反應底物；誘食劑A和B的脂肪感強于C；誘食劑C和A的烤香、焦糖香、醬香和豐滿度均強于B，誘食劑B的香氣較寡淡；在余味方面，誘食劑C高于誘食劑A和B。通過感官評定初步認為三種誘食劑的特征風味是肉香、脂肪香和烤香。

表3 感官評定結果

圖1 誘食劑的感官評價雷達圖

2.2 誘食劑的揮發(fā)性風味成分分析與比較 三種誘食劑的GC-MS結果如表4所示。在三種誘食劑中共檢測鑒定出40種揮發(fā)性成分，分別從誘食劑A、B、C中檢測鑒定出27種、24種和32種物質，其中醛類、雜環(huán)類、醇類物質的種類較多。醛類物質一般由脂肪酸氧化或美拉德反應產生，是誘食劑中脂肪香、烤香的重要來源 （Mottram等，2015）。從三種誘食劑中都鑒定出的醛類物質有2-甲基丁醛、異戊醛、辛醛丙二醇縮醛、菠蘿醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛和戊醛丙二醇縮醛。其中2-甲基丁醛、糠醛及菠蘿醛能呈現(xiàn)烘烤香氣，戊醛丙二醇縮醛能加強誘食劑的油脂感。三種誘食劑的醇類物質種類較少，糠醇具有焦糖香，甲硫醇有強烈蔥蒜氣息是肉香的重要來源，而2-乙基己醇具有脂肪香。從三種誘食劑鑒定出了低分子量，易揮發(fā)的丙位丁內酯，具有奶油特征香氣，可增強香氣飽滿度。從三種誘食劑中鑒定出的酮類物質為呋喃酮，具有焦糖香，可增加香氣厚實感。從誘食劑A和B中都鑒定出了1-羥基-2-丁酮和羥基丙酮，提供烤香和焦糖香，可見誘食劑中的酮類物質主要以焦糖香韻為主。酸類物質在誘食劑中的形成一般是通過油脂的氧化等過程（Zviely，2012），僅在誘食劑A中鑒定出乙酸，而酸在誘食劑中主要起調和口感的作用。雜環(huán)類物質主要來自于美拉德反應，是誘食劑中形成肉類風味的重要成分（Chen 等，2017；Liu 等，2015），三種誘食劑中均鑒定出2-甲基吡嗪、2-甲基呋喃和2-乙?；秽芴峁┛鞠愫徒固窍?；三種誘食劑都鑒定出了具有明顯肉類特征和蔥蒜氣息的含硫物質，如二甲基二硫醚是肉香型誘食劑中極為關鍵的成分，在肉類香精中也十分常見?？傮w來講三種誘食劑的主要呈香物質種類較相似。

2.3 誘食劑的特征性揮發(fā)性成分定量分析與比較 采用SDE-GC-O從誘食劑A、B、C中鑒定分別出18、17和22種香氣活性成分，結果如表5所示，其中甲硫醇、2-甲基丁醛、2-甲基吡嗪、苯甲醛和糠醛等具有較高的FD因子（Log3FD≥3），對誘食劑的香氣貢獻大。以保留指數(shù)為橫坐標，以Log3FD為縱坐標繪制FD圖譜如圖2所示，F(xiàn)D因子較高的成分大多處于靠前的位置即出峰較早，多為小分子物質。為進一步確認誘食劑中關鍵揮發(fā)性成分，通過內標法得到物質含量，并查找這些物質在水中的嗅覺閾值，得到OAV值，通常香氣成分的FD因子與OAV呈正相關。如表6所示，三種誘食劑中甲硫醇的OAV值最高，其次為2-甲基丁醛和菠蘿醛等。總體來講，甲硫醇、2-甲基丁醛、菠蘿醛、2-甲基吡嗪、糠醛具有較高的FD因子及OAV值，對整體風味貢獻大。由此可見三種誘食劑因美拉德配方和工藝相同，關鍵呈味物質的種類相似，但在含量上有差異。誘食劑A的肉香，脂肪香更突出，誘食劑C烤香更突出，誘食劑B特征香氣較淡，故通過引入FD因子和OAV值分析得出關鍵呈味物質能夠區(qū)分三種酶解液造成的香氣差異。

表4 三種誘食劑的主要揮發(fā)性成分

表5 誘食劑A、B、C的AEDA分析結果

圖2 誘食劑A、B、C的FD譜圖

2.4 電子鼻區(qū)分三種誘食劑的風味 電子鼻的雷達圖如圖3所示，三種樣品的輪廓清晰，表明穩(wěn)定性好。誘食劑A對于LY2/gCTL、LY2/gCT、LY2/AA傳感器的吸收度更高，表明誘食劑A中有更多寵物或烘烤類食品揮發(fā)出的特征風味物質（Yu等，2012）。誘食劑C的整體雷達輪廓最大，可見其香氣最強，與之前GC-MS和GC-O的分析結果相符。

電子鼻的主成分分析 （PCA）結果如圖4所示。PCA是通過對原始數(shù)據(jù)向量進行線性變換來尋找樣品間的差異的一種算法，該算法不丟失任何樣品信息，僅通過改變坐標軸來達到區(qū)分樣品的目的。由圖可知主成分1（PC1）和主成分2（PC2）共能反映99.988%的信息，證明檢測結果可信度高。由于PC1占比94.273%，故主要觀察三個樣品在橫軸上的距離，顯示誘食劑A與誘食劑B相似度更高，而A和C的差異性最大。

表6 誘食劑A、B、C中FD因子大于3的香氣化合物的OAV值

圖3 三種誘食劑的電子鼻雷達圖

圖4 誘食劑的主成分分析圖

2.5 誘食劑對狗糧適口性的改善 由圖5可知，誘食劑添加糧Aa與Bb在采食率和第一口偏好上沒有顯著差異，但Aa的采食率和第一口偏好都優(yōu)于Bb。表明誘食劑A對狗糧適口性的改善好于B，但不明顯。由圖6可知，Aa與Cc在采食率上就沒有顯著差異，但Aa的平均采食率高于Cc，而Aa的第一口偏好數(shù)顯著高于Cc，表明誘食劑A在對犬糧香氣改善明顯。選取Aa與空白糧D進行對照做驗證，結果如圖7所示，Aa的采食率和第一口偏好都顯著高于D。該組試驗中，試驗犬對Aa的第一口偏好次數(shù)占比82.5%，平均采食率達64%，驗證試驗表明誘食劑能顯著改善犬糧的適口性。

圖5 Aa和Bb采食率和第一口采食偏好的比較

圖6 Aa和Cc采食率和第一口采食偏好的比較

圖7 Aa和D采食率和第一口采食偏好的比較

利用Unscrambler v9.7做PLSR分析動物試驗結果與呈香物質之間的相關性，以GC-MS檢測得到的風味物質含量為X變量，誘食劑的應用效果（第一口偏好和采食率）為Y變量，如圖8所示，兩橢圓分別表示50%和100%的方差貢獻率。由圖中紅框區(qū)域可知，糠醇（焦糖氣息）、糠醛（杏仁香）、苯甲醛（苦杏仁香）、丙位丁內酯（奶香、果香）、乙酸（刺激性酸味）、2-乙基己醇（脂肪香）、甲硫醇（蔥蒜味、肉香）、菠蘿醛（烤土豆）、硫醇（肉香、烤香）、戊醛丙二醇縮醛（脂肪香）、5-甲基呋喃醛（焦糖香）和5-甲基-2-噻吩醛（杏仁香）與第一口偏好和采食率相關性較好，且以上這些物質在誘食劑A中含量更高，與AEDA分析結果相符。這體現(xiàn)出肉香、烤香、脂肪香和醬香更協(xié)調且能提供犬類偏愛的酸味口感的誘食劑對犬的吸引力更大（Frantz，2011），能有效提升狗糧的適口性。

圖8 動物試驗結果與風味物質間的相關性

3 結論

通過感官評定得出三種誘食劑的主體風味是肉香、烤香和脂肪香，誘食劑A的肉香較突出且香氣協(xié)調性更好，風味更宜人，而誘食劑C的烤香較突出。通過HS-SPME-GC-MS分析，從3種誘食劑中共鑒定出40種風味物質，以醛類、雜環(huán)類和醇類為主，具有肉香、烤香和脂肪香的風味特征。采用SDE-GC-O技術鑒定出了甲硫醇、糠醛、菠蘿醛、2-甲基吡嗪等有較高的FD因子和OAV值，對整體風味貢獻大，其中甲硫醇最突出，是肉香重要來源。誘食劑A的關鍵香氣物質的OAV較高，但烤香成分如2-甲基丁醛和2-甲基吡嗪的OAV低于誘食劑C，這與感官評價結果相符。采用電子鼻辨別三種誘食劑的差異，由PCA分析得出三種誘食劑差異較明顯，顯示不同酶對誘食劑風味有影響，誘食劑A和B更相似，與C區(qū)別較大。動物試驗結果顯示誘食劑添加糧Aa的第一口偏好與采食率均高于Bb和Cc，表明誘食劑A對狗糧風味的改善效果較好，而Aa的采食率和第一口偏好都顯著高于空白糧D，表明以肉香和烤香為主體的誘食劑能顯著改善狗糧的適口性。采用PLSR分析風味物質與第一口偏好及采食率的相關性，得出直接影響誘食劑風味優(yōu)劣的主要幾種風味物質成分有糠醇、糠醛、苯甲醛、丙位丁內酯、乙酸、2-乙基己醇、甲硫醇、菠蘿醛、硫醇、戊醛丙二醇縮醛、5-甲基呋喃醛和5-甲基-2-噻吩醛，與AEDA分析結果相符。