王 宇，李 碧，陽明賢，左之才

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

奶牛隱性乳房炎是一種奶牛乳房與乳汁均沒有臨床肉眼可見癥狀和病理變化的非臨床型乳房炎[1]，它發(fā)病范圍廣(全世界奶牛場(chǎng)均有發(fā)生)，感染率高，極易發(fā)展為臨床型乳房炎而導(dǎo)致奶牛的淘汰[2]。最為常見的隱性乳房炎病原是金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌，極具危害性的病原是綠膿桿菌[1，3]。目前，對(duì)于隱性乳房炎的主流檢測(cè)方法是細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，根據(jù)乳汁中體細(xì)胞數(shù)含量的多少來判斷是否患有隱性乳房炎[4]。這種方法是不完善的，缺點(diǎn)是結(jié)果判定的主觀性較強(qiáng)，容易出現(xiàn)主觀誤差[5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)臨床樣本中病原菌的檢驗(yàn)大多沿用細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定方法，檢驗(yàn)步驟繁瑣，周期較長(zhǎng)，需要將病原菌從樣本中分離純化出來，才能作進(jìn)一步的鑒定，難以滿足臨床需求。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)能彌補(bǔ)微生物學(xué)培養(yǎng)和生化方法進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定的局限性，是一種新的分子水平細(xì)菌分類和鑒定方法，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床診斷中有很廣闊的前景。多重PCR(multiplex PCR)技術(shù)因具有高效快捷、特異敏感、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。1988年，Chamberlain等[6]首先使用多重PCR技術(shù)對(duì)人的杜氏營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)進(jìn)行檢測(cè)，隨后，多重PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。QIAGEN公司研制出適于多重PCR反應(yīng)的新型緩沖系統(tǒng)，并已研制出多重PCR試劑盒，可以直接用于相關(guān)基因的檢測(cè)分析。國(guó)內(nèi)運(yùn)用該技術(shù)檢測(cè)病原菌已日漸成熟，在臨床診斷方法已經(jīng)取得一些較有意義的結(jié)果。覃芳蕓等[7]分別根據(jù)鏈球菌屬特異性gdh、豬鏈球菌種特異性16S rRNA和豬鏈球菌2型特異性cps2J等基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，在豬鏈球菌病的臨床診斷上取得了一定的成果。與傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法相比，馬保臣等[8]建立的檢測(cè)乳房炎病原菌的多重PCR方法對(duì)金黃色葡萄球菌和酵母真菌具有更高的檢出率。

目前，乳汁病原微生物檢查、普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、基因芯片、凝集法等均應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域[9]。但奶牛隱性乳房炎經(jīng)常出現(xiàn)多種病原混合感染的情況，以上的方法檢測(cè)通量均不高。為此，本研究擬建立無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌多重PCR檢測(cè)體系，以期為奶牛隱性乳房炎快速診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、綠膿桿菌(分離于隱性乳房炎奶牛)、芽孢桿菌、大腸埃希菌、糞球菌、檸檬酸桿菌、不動(dòng)桿菌、腐生葡萄球菌(分離于隱性乳房炎奶牛)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有：TSA肉湯培養(yǎng)基、TSA瓊脂培養(yǎng)基、KF培養(yǎng)基、卵黃甘露醇高鹽培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯、Taq酶等。主要儀器有：NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)、高壓滅菌鍋、PCR儀器、電泳儀、超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的無乳鏈球菌16S rRNA基因(GenBank登錄號(hào)為X59032.1)、金黃色葡萄球菌NUC基因(GenBank登錄號(hào)為DQ507382.1)、綠膿桿菌ETA基因(GenBank登錄號(hào)為KC847702.1)并參考文獻(xiàn)各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書操作(上海生工公司)，提取細(xì)菌DNA模板，置-20 ℃保存。

1.2.3 單一PCR檢測(cè)的條件優(yōu)化

單一PCR的反應(yīng)體系是50 μL，其中初始值是Taq酶的混合物(Mix)25 μL、上游引物和下游引物各1 μL(10 mmol·L-1)、細(xì)菌DNA 2 μL、雙蒸水21 μL。跟據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整引物濃度(10～100 mmol·L-1)、細(xì)菌DNA濃度、酶(Mix)的濃度等變量。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 1 min，退火溫度50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化與體系的建立

雙重PCR模板：以金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌的基因組DNA為模板，各加入1 μL DNA(金黃色葡萄球菌DNA濃度為59.7 ng·μL-1、綠膿桿菌DNA濃度為50 ng·μL-1)；以無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，按2∶1加入無乳鏈球菌DNA 2 μL，金黃色葡萄球菌DNA 1 μL(金黃色葡萄球菌DNA濃度為59.7 ng·μL-1、無乳鏈球菌DNA濃度為66.8 ng·μL-1)；以無乳鏈球菌與綠膿桿菌的基因組DNA為模板，加入無乳鏈球菌DNA 2 μL，綠膿桿菌DNA 1 μL(無乳鏈球菌DNA濃度為66.8 ng·μL-1、綠膿桿菌DNA濃度為50 ng·μL-1)。多重PCR模板：綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌基因組DNA模板各1 μL(金黃色葡萄球菌DNA濃度為59.7 ng·μL-1、綠膿桿菌DNA濃度為50 ng·μL-1)、無乳鏈球菌基因組DNA模板2 μL(DNA濃度為66.8 ng·μL-1)。

根據(jù)單重PCR優(yōu)化結(jié)果，以無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌3種菌的基因組DNA為常量，退火溫度(42～62 ℃)、引物濃度、Mix濃度為變量，95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，退火溫度42～62 ℃(梯度PCR) 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；以確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.5 三重PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

多重PCR優(yōu)化完成后，根據(jù)優(yōu)化完成的條件體系進(jìn)行5次重復(fù)性試驗(yàn)。

1.2.6 PCR檢測(cè)的特異性試驗(yàn)

在完成PCR檢測(cè)的優(yōu)化之后，對(duì)其進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。在相同的條件和引物(加入特異性引物與16S rRNA通用引物)下分別對(duì)金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、綠膿桿菌與陰性對(duì)照組(大腸埃希菌、糞球菌、假單孢菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、不動(dòng)桿菌)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件體系應(yīng)用優(yōu)化完成的(先單一PCR反應(yīng)，再雙重PCR反應(yīng)，最后三重PCR反應(yīng))，重復(fù)試驗(yàn)2次，檢測(cè)其特異性。

1.2.7 PCR檢測(cè)的靈敏性試驗(yàn)

對(duì)無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌進(jìn)行菌液濃度測(cè)定，計(jì)算1 mL菌液的濃度。將計(jì)算好的1 mL菌液進(jìn)行DNA提取，稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66個(gè)濃度梯度分別為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件體系應(yīng)用優(yōu)化完成的(先單一PCR反應(yīng)，再雙重PCR反應(yīng)，最后三重PCR反應(yīng))，檢測(cè)其靈敏性。

1.2.8 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓為120 V，時(shí)間30 min。

表1引物名稱、序列、擴(kuò)增片段大小

Table1Name of primers， primer sequences and size of product

靶細(xì)菌Target引物名稱Name of primers5'-3'端的引物序列5'-3'Primer sequences擴(kuò)增片段大小Size/bp無乳鏈球菌S. agalactiae[10]16S-F16S-RAAGGAAACCTGCCATTTGTTAACCTAGTTTCTTTAAAACTAGAA270金黃色葡萄球菌S. aureus[11]NUC-FNUC-RCACCTGAAACAAAGCATCCTAATATACGCTAAGCCACGTCCAT153綠膿桿菌P. aeruginosaETA-FETA-RCGGTAACCAGCTCAGCCACACGATGACTGATGACCGTGGG375細(xì)菌的通用引物16S rRNA[12]16S通用引物-F 16S universal primer-F16S通用引物-R 16S universal primer-RAGAGTTTGATCCTGGCTCAGTACGGCTACCTTGTTACGACTT1500

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR優(yōu)化結(jié)果

多重PCR最佳反應(yīng)條件為(50 μL體系)：25 μL的Mix、3種細(xì)菌特異性引物的上游和下游引物各1 μL、綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌基因組DNA模板各1 μL(金黃色葡萄球菌DNA濃度為59.7 ng·μL-1、綠膿桿菌DNA濃度為50 ng·μL-1)、無乳鏈球菌基因組DNA模板2 μL(DNA濃度為66.8 ng·μL-1)、15 μL的雙蒸水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、56.9 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；12 ℃保存(圖1)。

2.2 PCR特異性結(jié)果

2.2.1 無乳鏈球菌特異性結(jié)果

無乳鏈球菌與芽孢桿菌、大腸埃希菌、糞球菌、檸檬酸桿菌、不動(dòng)桿菌、腐生葡萄球菌在相同的條件下加入無乳鏈球菌特異性引物與16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果具有高特異性(圖2)。

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，金黃色葡萄球菌；3～4，無乳鏈球菌；5～6，綠膿桿菌；7～8，無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌；9～10，金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌；11～12，綠膿桿菌與無乳鏈球菌；13～14，無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌；15～16，陰性對(duì)照組。M， DNA marker DL2000; 1-2， S. aureus; 3-4， S. agalactiae; 5-6， P. aeruginosa; 7-8， S. agalactiae and S. aureus; 9-10， S. aureus and P. aeruginosa; 11-12， P. aeruginosa and S. agalactiae; 13-14， S. agalactiae， S. aureus and P. aeruginosa; 15-16， Negative control group.圖1 單重PCR與多重PCR結(jié)果Fig.1 Single and multiplex PCR results

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，無乳鏈球菌；3，芽孢桿菌；4，大腸埃希菌；5，糞球菌；6，檸檬酸桿菌；7，不動(dòng)桿菌；8，腐生葡萄球菌。1～8均加入無乳鏈球菌特異性引物與16S通用引物。M， DNA marker DL2000; 1-2， S. agalactiae; 3， Bacillus; 4， E. coli; 5， Dungococcus; 6， Citrobacter; 7， Acinetobacter; 8， Staphylococcus saprophyticus. 1-8 were added with S. agalactiae-specific primers and 16S universal primers.圖2 無乳鏈球菌特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity test results for S. agalactiae

2.2.2 綠膿桿菌特異性結(jié)果

綠膿桿菌與芽孢桿菌、大腸埃希菌、糞球菌、檸檬酸桿菌、不動(dòng)桿菌、腐生葡萄球菌在相同的條件下加入綠膿桿菌特異性引物與16S通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果具有高特異性(圖3)。

2.2.3 金黃色葡萄球菌特異性結(jié)果

金黃色葡萄球菌與芽孢桿菌、大腸埃希菌、糞球菌、檸檬酸桿菌、不動(dòng)桿菌、腐生葡萄球菌在相同的條件下加入金黃色葡萄球菌特異性引物與16S通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果具有高特異性(圖4)。

2.2.4 無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌雙重PCR的特異性結(jié)果

無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌雙重PCR具有高特異性(圖5)。

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，綠膿桿菌；3，芽孢桿菌；4，大腸埃希菌；5，糞球菌；6，檸檬酸桿菌；7，不動(dòng)桿菌；8，腐生葡萄球菌。1～8均加入綠膿桿菌特異性引物與16S通用引物。M， DNA marker DL2000; 1-2， P. aeruginosa; 3， Bacillus; 4， E. coli; 5， Dungococcus; 6， Citrobacter; 7， Acinetobacter; 8， Staphylococcus saprophyticus. 1-8 were added with P. aeruginosa-specific primers and 16S universal primers.圖3 綠膿桿菌特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specific test results for P. aeruginosa

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，金黃色葡萄球菌；3，芽孢桿菌；4，大腸埃希菌；5，糞球菌；6，檸檬酸桿菌；7，不動(dòng)桿菌；8，腐生葡萄球菌。1～8均加入金黃色葡萄球菌特異性引物與16S通用引物。M， DNA marker DL2000; 1-2， S. aureus; 3， Bacillus; 4， E. coli; 5， Dungococcus; 6， Citrobacter; 7， Acinetobacter; 8， Staphylococcus saprophyticus. 1-8 were added with S. aureus-specific primers and 16S universal primers.圖4 金黃色葡萄球菌特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specific test results for Staphylococcus aureus

2.2.5 無乳鏈球菌與綠膿桿菌雙重PCR的特異性結(jié)果

無乳鏈球菌與綠膿桿菌雙重PCR與陰性對(duì)照相比具有高特異性(圖6)。

2.2.6 金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌雙重PCR的特異性結(jié)果

金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌雙重PCR與陰性對(duì)照相比具有高特異性(圖7)。

2.2.7 無乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

無乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌多重PCR與陰性對(duì)照相比具有高特異性(圖8)。

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，金黃色葡萄球菌與無乳鏈球菌；3，芽孢桿菌；4，大腸埃希菌；5，芽孢桿菌與大腸埃希菌。1～5均加入金黃色葡萄球菌與無乳鏈球菌的特異性引物、16S通用引物。M， DNA marker DL2000; 1-2， S. agalactiae and S. aureus; 3， Bacillus; 4， E. coli; 5， Bacillus and E. coli. 1-5 were added with specific primers for S. agalactiae and S. aureus， as well as 16S universal primers.圖5 無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌雙重PCR的特異性結(jié)果Fig.5 Dual-PCR specific results for S. agalactiae and S. aureus

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，無乳鏈球菌與綠膿桿菌；3，糞球菌；4，檸檬酸桿菌；5，糞球菌加檸檬酸桿菌。1～5均加入無乳鏈球菌與綠膿桿菌的特異性引物，16S通用引物。M， DNA marker DL2000; 1-2， S. agalactiae and P. aeruginosa; 3， Dungococcus; 4， Citrobacter; 5， Dungococcus and Citrobacter. 1-5 were added with specific primers for S. agalactiae and P. aeruginosa， as well as 16S universal primers.圖6 無乳鏈球菌與綠膿桿菌雙重PCR的特異性結(jié)果Fig.6 Dual-PCR specific results for S. agalactiae and P. aeruginosa

2.3 PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 單重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌在1 mL腦心浸液肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h后經(jīng)過菌落計(jì)數(shù)測(cè)出濃度分別為8×107、4×107、1.5×109CFU·mL-1。無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌1 mL菌液經(jīng)試劑盒抽提DNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，分別為66.8、59.7、50.0 ng·μL-1。無乳鏈球菌的靈敏性在8×104CFU·mL-1-6.68×10-2ng·μL-1、金黃色葡萄球菌的靈敏性在4×104CFU·mL-1-5.97×10-2ng·μL-1、綠膿桿菌的靈敏性在1.5×105CFU·mL-1-5×10-3ng·μL-1(圖9-圖11)。

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌；3，不動(dòng)桿菌；4，腐生葡萄球菌；5，不動(dòng)桿菌加腐生葡萄球菌。1～5均加入金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌的特異性引物與16S通用引物。M， DNA standard DL2000; 1-2， S. aureus and P. aeruginosa; 3， Acinetobacter; 4， Staphylococcus saprophyticus; 5， Acinetobacter and Staphylococcus saprophyticus; 1-5 were added with specific primers for S. aureus and P. aeruginosa， as well as 16S universal primers.圖7 金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌雙重PCR的特異性結(jié)果Fig.7 Dual-PCR specific results for S. aureus and P. aeruginosa

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～2，無乳鏈球菌加金黃色葡萄球菌加綠膿桿菌；3，芽孢桿菌加大腸埃希菌加糞球菌；4，不動(dòng)桿菌加腐生葡萄球菌加檸檬酸桿；5，芽孢桿菌加大腸埃希菌加不動(dòng)桿菌；6，不動(dòng)桿菌加腐生葡萄球菌加大腸埃希菌；7，芽孢桿菌加大腸埃希菌加腐生葡萄球菌；8，不動(dòng)桿菌加腐生葡萄球菌加芽孢桿菌。1～8均加入無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的特異性引物與16S通用引物。M， DNA marker DL2000; 1-2， S. agalactiae， S. aureus and P. aeruginosa; 3， Bacillus， E. coli and Dungococcus; 4， Acinetobacter， Staphylococcus saprophyticus and Citrobacter; 5， Bacillus， E. coli and Acinetobacter ; 6， Acinetobacter， Staphylococcus saprophyticus and E. coli; 7， Bacillus， E. coli and Staphylococcus saprophyticus; 8， Acinetobacter and Staphylococcus saprophyticus and Bacillus. 1-8 were added with 4 primers including S. agalactiae， S. aureus， P. aeruginosa-specific primers and 16S universal primers.圖8 無乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Multiplex PCR specific test results for S. agalactiae， P. aeruginosa and S. aureus

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1，8×106 CFU·mL-1-6.68×100 ng·μL-1；2，8×105 CFU·mL-1-6.68×10-1 ng·μL-1；3，8×104 CFU·mL-1-6.68×10-2 ng·μL-1；4，8×103 CFU·mL-1-6.68×10-3 ng·μL-1；5，8×102 CFU·mL-1-6.68×10-4ng·μL-1；6，8×101 CFU·mL-1-6.68×10-5 ng·μL-1；7，陰性對(duì)照。M， DNA marker DL2000; 1， 8×106 CFU·mL-1-6.68×100 ng·μL-1; 2， 8×105 CFU·mL-1-6.68×10-1 ng·μL-1; 3， 8×104 CFU·mL-1-6.68×10-2 ng·μL-1; 4， 8×103 CFU·mL-1-6.68×10-3 ng·μL-1; 5， 8×102 CFU·mL-1-6.68×10-4 ng·μL-1; 6， 8×101 CFU·mL-1-6.68×10-5 ng·μL-1; 7， Negative control.圖9 無乳鏈球菌靈敏性試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Sensitivity test results for S. agalactiae

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1，1.5×108 CFU·mL-1-5×100 ng·μL-1；2，1.5×107 CFU·mL-1-5×10-1 ng·μL-1；3，1.5×106 CFU·mL-1-5×10-2 ng·μL-1；4，1.5×105 CFU·mL-1-5×10-3ng·μL-1；5，1.5×104 CFU·mL-1-5×10-4 ng·μL-1；6，1.5×103 CFU·mL-1-5×10-5 ng·μL-1；7，陰性對(duì)照。M， DNA marker DL2000; 1， 1.5×108 CFU·mL-1-5×100 ng·μL-1; 2， 1.5×107 CFU·mL-1-5×10-1 ng·μL-1; 3， 1.5×106 CFU·mL-1-5×10-2 ng·μL-1; 4， 1.5×105 CFU·mL-1-5×10-3 ng·μL-1; 5， 1.5×104 CFU·mL-1-5×10-4 ng·μL-1; 6， 1.5×103 CFU·mL-1-5×10-5 ng·μL-1; 7， Negative control.圖10 綠膿桿菌靈敏性試驗(yàn)結(jié)果Fig.10 Sensitivity test results for P. aeruginosa

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1，4×106 CFU·mL-1-5.97×100 ng·μL-1；2，4×105 CFU·mL-1-5.97×10-1 ng·μL-1；3，4×104 CFU·mL-1-5.97×10-2ng·μL-1；4，4×103 CFU·mL-1-5.97×10-3 ng·μL-1；5，4×102 CFU·mL-1-5.97×10-4ng·μL-1；6，4×101 CFU·mL-1-5.97×10-5 ng·μL-1；7，陰性對(duì)照。M， DNA marker DL2000; 1， 4×106 CFU·mL-1-5.97×100 ng·μL-1; 2， 4×105 CFU·mL-1-5.97×10-1 ng·μL-1; 3， 4×104 CFU·mL-1-5.97×10-2ng·μL-1; 4， 4×103 CFU·mL-1-5.97×10-3 ng·μL-1; 5， 4×102 CFU·mL-1-5.97×10-4ng·μL-1; 6， 4×101 CFU·mL-1-5.97×10-5 ng·μL-1; 7， Negative control.圖11 金黃色葡萄球菌靈敏性試驗(yàn)Fig.11 Sensitivity test results for S. aureus

2.3.2 多重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌雙重PCR在稀釋度10-2處能檢出基因條帶。無乳鏈球菌與綠膿桿菌雙重PCR在稀釋度10-3處能檢出基因條帶。綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌雙重PCR在稀釋度10-2處能檢出基因條帶。無乳鏈球菌與綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的多重PCR在稀釋度10-3處能檢出基因條帶(圖12)。

2.4 三重PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

三重PCR重復(fù)試驗(yàn)5次，結(jié)果具有良好的重復(fù)性(圖13)。

3 討論

奶牛乳房炎是目前尚未徹底解決的奶牛常見和多發(fā)的疾病之一，是奶牛乳腺受到蚊蟲叮咬、物理刺激、病原微生物等環(huán)境刺激時(shí)，產(chǎn)生的一系列不同程度的炎癥反應(yīng)[13]。根據(jù)是否出現(xiàn)明顯臨床癥狀，將其分為臨床乳房炎和隱性乳房炎，其中隱性乳房炎發(fā)病率最高，占牛群無明顯臨床乳房炎癥狀的奶牛的20%～50%，給奶牛場(chǎng)造成極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[14]。引起奶牛隱性乳房炎的病原較多，臨床上可在隱性乳房炎奶牛體內(nèi)同時(shí)分離到多種微生物病原，如細(xì)菌、支原體、真菌、病毒等。已有文獻(xiàn)研究表明，較常見的隱性乳房炎病原有23種，其中細(xì)菌占14種，霉形體2種，真菌與病毒各7種[15]。本實(shí)驗(yàn)著重通過構(gòu)建細(xì)菌檢測(cè)方法分析隱性乳房炎的發(fā)病情況。目前，從致病菌的傳染性、普遍性及危害程度等角度來看，導(dǎo)致奶牛乳房炎最重要的致病菌主要為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和綠膿桿菌[16-17]。

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1，無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-1的雙重PCR；2，無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-2的雙重PCR；3，無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-3的雙重PCR；4，無乳鏈球菌與綠膿桿菌稀釋梯度為10-1的雙重PCR；5，無乳鏈球菌與綠膿桿菌稀釋梯度為10-2的雙重PCR；6，無乳鏈球菌與綠膿桿菌稀釋梯度為10-3的雙重PCR；7，綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-1的雙重PCR；8，綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-2的雙重PCR；9，綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-3的雙重PCR；10，無乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-1的多重PCR；11，無乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-2的多重PCR；12，無乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-3的多重PCR；13～16，陰性對(duì)照。M， DNA marker DL2000; 1， Double PCR for S. agalactiae and S. aureus with dilution gradient of 10-1; 2， Double PCR for S. agalactiae and S. aureus with dilution gradient of 10-2; 3， Double PCR for S .agalactiae and S .aureus with dilution gradient of 10-3; 4， Double PCR for S. agalactiae and P. aeruginosa with dilution gradient of 10-1; 5， Double PCR for S. agalactiae and P. aeruginosa with dilution gradient of 10-2; 6， Double PCR for S. agalactiae and P. aeruginosa with dilution gradient of 10-3; 7， Double PCR for P. aeruginosa and S .aureus with dilution gradient of 10-1; 8， Double PCR for P. aeruginosa and S. aureus with dilution gradient of 10-2; 9， Double PCR for P. aeruginosa and S. aureus with dilution gradient of 10-3; 10， Multiplex PCR for S. agalactiae， S. aureus and P. aeruginosa with dilution gradient of 10-1; 11， Multiplex PCR for S. agalactiae， S. aureus and P. aeruginosa with dilution gradient of 10-2; 12， S. agalactiae， S. aureus and P. aeruginosa with dilution gradient of 10-3; 13-16， Negative control.圖12 多重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果Fig.12 Sensitivity test results for multiplex PCR

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～5，無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌；6，陰性對(duì)照。M， DNA marker DL2000; 1-5， S. agalactiae， S. aureus and P. aeruginosa; 6， Negative control.圖13 三重PCR重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Fig.13 Repeat test results for triple PCR

無乳鏈球菌亦稱B群鏈球菌，是一種專性乳腺寄生的具有高度傳染性的致病菌，多發(fā)于隱性乳房炎，也可造成乳腺組織的纖維化[18]，還可引起新生兒敗血癥、肺炎和腦膜炎，奶牛乳腺炎及魚類腦膜炎[19]，是一種人獸共患病的病原菌。無乳鏈球菌的致病性與其產(chǎn)生的多種毒力因子有關(guān)，已報(bào)道的有纖維蛋白原蛋白、菌毛蛋白、β溶血素和脂磷壁酸等[20-21]。在奶牛乳房炎中，乳腺組織發(fā)生損傷，為了修復(fù)損傷和改造炎性滲出物，奶牛機(jī)體成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，造成乳腺組織的纖維化。金黃色葡萄球菌屬于傳染性致病菌，是引起奶牛隱性乳房炎最主要的病原微生物之一，它不僅能逃逸宿主牛的天然防御系統(tǒng)，還能摧毀宿主的免疫系統(tǒng)[22-23]，常由乳頭管侵入，寄居于乳頭管后再向乳腺組織內(nèi)部蔓延，造成急性乳房炎或慢性乳房炎；除降低產(chǎn)奶量外，還會(huì)導(dǎo)致乳區(qū)纖維化和小胳腫，造成永久性實(shí)質(zhì)病變[24]。金黃色葡萄球菌也是最易產(chǎn)生抗性菌株的病原菌之一，它通過產(chǎn)生青霉素酶、L-型缺失細(xì)胞壁變種株等機(jī)制，使其對(duì)抗生素耐藥性大大增強(qiáng)，臨床治療日漸困難[25]。綠膿桿菌為假單胞菌屬條件性致病菌，該菌廣泛存在于自然界的水、土壤，空氣及動(dòng)物的腸道和皮膚中。其代謝產(chǎn)物中有一種毒力很強(qiáng)的外毒素A，是一種致死性外毒素。外毒素A可用福爾馬林脫毒成為類毒素，使其毒力減弱，有防治綠膿桿菌感染的作用[26]。另外還有一種溶血毒素為磷脂酶C，它能給入侵的細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)，增加綠膿桿菌的毒力[27]。常常是因?yàn)槟膛Ｈ榉垦灼渌≡腥径鸬睦^發(fā)感染，綠膿桿菌引起的乳房炎常為混合感染。由綠膿桿菌引起的隱性乳房炎往往會(huì)在很短的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)變成臨床型乳房炎，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致奶牛直接淘汰[28]。

無乳鏈球菌16S rRNA基因具有高度的保守性和特異性并且該基因序列足夠長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌NUC基因具有熱穩(wěn)定性是檢測(cè)金黃色葡萄球菌的重要標(biāo)志[29]，綠膿桿菌ETA基因是編碼外毒素的重要基因，是綠膿桿菌標(biāo)志性基因。因此本研究根據(jù)無乳鏈球菌16S rRNA基因、金黃色葡萄球菌NUC基因、綠膿桿菌ETA基因參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性引物。單一PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果表示，無乳鏈球菌最低檢出限是DNA濃度為6.68×10-2ng·μL-1，對(duì)應(yīng)菌液濃度為8×104CFU·mL-1；金黃色葡萄球菌最低檢出限為DNA濃度5.97×10-2ng·μL-1，對(duì)應(yīng)菌液濃度為4×104CFU·mL-1；綠膿桿菌最低檢出限為DNA濃度5×10-3ng·μL-1，對(duì)應(yīng)菌液濃度為1.5×105CFU·mL-1。多重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌雙重PCR在稀釋度10-2處能檢出基因條帶；無乳鏈球菌與綠膿桿菌雙重PCR在稀釋度10-3處能檢出基因條帶；綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌雙重PCR在稀釋度10-2處能檢出基因條帶；無乳鏈球菌與綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的多重PCR在稀釋度10-3處能檢出基因條帶。因此，無論是多重PCR，還是單重PCR，在稀釋度為10-2以下均能檢測(cè)出基因條帶，對(duì)應(yīng)的菌液濃度范圍為1.5×106CFU·mL-1以上均能檢測(cè)出基因條帶。單一PCR與多重PCR特異性結(jié)果顯示，3種特異性引物與16S rRNA通用引物之間分別具有較高的特異性，3種特異性引物擴(kuò)增條帶與GenBank上和細(xì)菌基因序列同源性為99%。三重PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，具有良好的重復(fù)性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的多重PCR方法具有快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特征，可有效用于奶牛隱性乳房炎中無乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。