夏 魏，李祖光，楊 華，吉小鳳，汪建妹，錢鳴蓉，*

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine， SMM)是磺胺類(sulfonamides， SAs)抗菌藥之一，具有抗菌和預(yù)防細(xì)菌感染的作用，常用于畜牧業(yè)、獸醫(yī)臨床預(yù)防，以及細(xì)菌性疾病控制，以提高動(dòng)物抗病力和改善生產(chǎn)性能[1-2]。然而該類藥物的超劑量使用或?yàn)E用會(huì)使藥物殘留期延長(zhǎng)，人類食用此類動(dòng)物源性產(chǎn)品后，可能會(huì)增強(qiáng)對(duì)該類抗菌藥物的耐藥性，對(duì)人體健康有潛在危害[3-4]。

藥物在動(dòng)物體內(nèi)一般經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄4個(gè)過程，不同生物的殘留消除規(guī)律有所不同[5]。目前，磺胺類藥物在豬、猴、兔、魚等動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究均有報(bào)道[6-7]，但雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留消除規(guī)律的相關(guān)研究較少，僅在測(cè)定方法方面有部分報(bào)道。為保障雞蛋質(zhì)量安全，維護(hù)消費(fèi)者利益，本研究采用蛋雞投藥模擬試驗(yàn)，收集停藥后一段時(shí)間內(nèi)的雞蛋，測(cè)定雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶藥物殘留量，以期探析磺胺間甲氧嘧啶殘留在雞蛋中的消除規(guī)律，并給出相應(yīng)的休藥期建議，為實(shí)際生產(chǎn)過程中保障雞蛋產(chǎn)品質(zhì)量安全提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器

30%磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉，浙江杭州愛力邁；色譜純乙腈和甲醇，德國(guó)Merck公司；無(wú)水乙酸鈉(純度99.0%)，溫州市化學(xué)用料廠；無(wú)水硫酸鈉(純度98.0%)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(純度99.5%)，廣東光華科技股份有限公司；甲酸(純度99.0%)，美國(guó)ACS恩科化學(xué)。試驗(yàn)用水為Milli-Q系統(tǒng)純化水?；前烽g甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取適量藥物，用甲醇溶解，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

QTRAP 6500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)，美國(guó)AB SCIEX公司；T25勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司；EOFO-945616渦旋儀，美國(guó)Talboys公司；Biofuge Primo R離心機(jī)，德國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 飼養(yǎng)管理及給藥方法

選取32周齡、體質(zhì)量1.6 kg的籠養(yǎng)蛋雞(品種為海蘭白)開展試驗(yàn)。對(duì)照組(20只蛋雞)自由采食和飲水(無(wú)藥物添加)；試驗(yàn)組分為高劑量組(30只蛋雞)和低劑量組(30只蛋雞)，分別以標(biāo)簽推薦最高劑量及其1/2劑量開展試驗(yàn)，藥物濃度分別為159 mg·L-1和79.5 mg·L-1，添加至蛋雞飲水中。試驗(yàn)組蛋雞自由采食和飲水(有藥物添加)，連續(xù)喂藥5 d后停藥。休藥期每天于同一時(shí)間點(diǎn)收集雞蛋，并測(cè)定雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶的殘留量，取樣時(shí)間持續(xù)至雞蛋中無(wú)藥物殘留檢出。

1.3 采樣及樣品處理

停藥期間，每天同一時(shí)間點(diǎn)收集所產(chǎn)雞蛋，每個(gè)取樣點(diǎn)各劑量組隨機(jī)選取5個(gè)雞蛋混勻?yàn)橐粋€(gè)樣品，制備5個(gè)重復(fù)，樣品于-20 ℃冰箱冷凍保存。

稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈(含體積分?jǐn)?shù)1%乙酸)，渦旋1 min，超聲15 min，8 000 r·min-1離心3 min。上清液轉(zhuǎn)移至裝有0.5 g無(wú)水乙酸鈉和2.0 g無(wú)水硫酸鎂的50 mL離心管中，渦旋1 min，8 000 r·min-1離心3 min，取1.5 mL上清液于裝有100 mg C18和150 mg無(wú)水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋1 min，10 000 r·min-1離心3 min，取0.5 mL上清液至裝有0.5 mL去離子水的2 mL離心管中，混勻后，過0.20 μm微孔濾膜，進(jìn)UPLC-MS/MS分析測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，樣品溫度25 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，流速0.2 mL·min-1，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液+2 mmol·L-1甲酸銨水溶液(A)和甲醇(B)，具體洗脫程序見表1。

表1液相色譜梯度洗脫程序

Table1Gradient elution program of liquid chromatography

t/min流速Flow rate/(mL·min-1)流動(dòng)相A、B體積比Volume ratio of mobile phase A to B00.295∶50.50.295∶51.00.275∶253.00.275∶2511.00.220∶8012.00.20∶10013.00.20∶10013.10.295∶515.00.295∶5

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式，多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式，氣簾氣和碰撞氣均為氮?dú)?，離子噴霧電壓5 500 V，離子源溫度450 ℃，霧化溫度300 ℃。以一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中磺胺間甲氧嘧啶的準(zhǔn)分子離子作為各自的母離子，對(duì)其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，以峰度較強(qiáng)的二級(jí)碎片離子作為各自的定量離子，以上述離子反應(yīng)進(jìn)行定量分析，具有較高的專屬性。具體地：定量離子對(duì)281.2/156.1，碰撞能量26 eV，去簇電壓87 eV，保留時(shí)間6.66 min；定性離子對(duì)281.2/108.1，碰撞能量38 eV，去簇電壓87 eV，保留時(shí)間6.66 min。

1.5 方法驗(yàn)證

本試驗(yàn)采用外標(biāo)法定量，配置系列磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.1、1.0、5.0、20、100 μg·L-1，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以3倍信噪比計(jì)算的值作為檢出限，以10倍信噪比計(jì)算的值作為定量限。在分析實(shí)際樣品前，對(duì)其進(jìn)行3個(gè)濃度水平(20、50、100 μg·kg-1)的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)試5次。

1.6 雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留在休藥后的降解動(dòng)力學(xué)分析

對(duì)休藥后雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留量做一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用下式擬合：

Ct=C0e-kt，

(1)

(2)

式(1)、(2)中：Ct為t時(shí)測(cè)得雞蛋樣品中的藥物濃度，C0為喂藥期結(jié)束時(shí)(第1天)雞蛋樣品中該藥物的濃度，k為消除速率常數(shù)，t1/2為凈化半衰期。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制系列磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，在設(shè)定好的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，樣品色譜圖如圖1所示。根據(jù)保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的峰面積(y)與其濃度(x)進(jìn)行線性回歸，磺胺間甲氧嘧啶在0.1～100 μg·L-1線性良好，回歸方程為y=88 924x+42 202，決定系數(shù)R2=0.999 7(圖2)。

2.1.2 檢測(cè)限、定量限和回收率

經(jīng)測(cè)算，本文檢測(cè)方法的檢出限為0.03 μg·kg-1，定量限為0.1 μg·kg-1，試驗(yàn)條件下磺胺間甲氧嘧啶的回收率為80.9%～101.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～11.5%，方法穩(wěn)定可靠。

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng)

圖1 雞蛋樣品中磺胺間甲氧嘧啶的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of sulfamonomethoxine in egg sample

圖2 UPLC-MS/MS測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of sulfamonomethoxine detected by UPLC-MS/MS

雞蛋富含各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如脂肪、蛋白質(zhì)等，對(duì)目標(biāo)物的測(cè)定可能會(huì)產(chǎn)生一定影響。為了解雞蛋樣品基質(zhì)對(duì)磺胺間甲氧嘧啶殘留定量測(cè)定的影響，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先，選擇未檢出的陰性樣品按照1.3節(jié)方法進(jìn)行凈化處理后，在基質(zhì)液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.1、1.0、10、20、50、100 μg·L-1，然后對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，得到回歸方程y=95 957x+42 371，R2=0.999 5。將該斜率值與同系列標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸曲線方程的斜率值進(jìn)行比較，兩者的比值為0.93，說(shuō)明通過前處理方法獲得的樣品中基質(zhì)效應(yīng)較小，可采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)行定量分析。

2.2 休藥后雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留變化

對(duì)照組雞蛋樣品中無(wú)殘留檢出。如表2所示，隨著休藥時(shí)間延長(zhǎng)，雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留量逐漸降低，直至低于檢測(cè)限，高劑量組的雞蛋中藥物殘留消除時(shí)間明顯長(zhǎng)于低劑量組。高劑量組在休藥后第1、3、5、10、16、20、24天，磺胺間甲氧嘧啶殘留量分別為2 497.3、220.1、38.9、6.0、1.3、0.5、0.1 μg·kg-1；低劑量組在休藥后第1、3、5、10、16天，磺胺間甲氧嘧啶殘留量分別為694.3、45.2、15.5、1.5、0.1 μg·kg-1。參照原農(nóng)業(yè)部2002年第235號(hào)公告，禽肉中磺胺間甲氧嘧啶最大殘留限量為100 μg·kg-1，則高劑量組在休藥后第5天、低劑量組在休藥后第3天，雞蛋中的磺胺間甲氧嘧啶殘留量即低于此規(guī)定，綜合來(lái)看，休藥期建議在5 d以上。若參照方法檢測(cè)限，要獲得磺胺間甲氧嘧啶殘留無(wú)檢出的雞蛋，休藥期建議在25 d以上。

表2休藥后雞蛋磺胺間甲氧嘧啶的殘留量(n=5)

Table2Residue of SMM in egg without sulfamonomethoxine injection(n=5)

休藥后時(shí)間Withdrawalperiod/d磺胺間甲氧嘧啶殘留量SMM residue content/(μg·kg-1)高劑量組High-dose group低劑量組Low-dose group12497.3±440.78694.3±137.742341.5±57.50124.1±13.043220.1±40.8145.2±7.874100.5±16.5426.1±4.78538.9±6.9215.5±2.75624.6±4.6110.7±2.12712.1±1.906.1±0.6888.9±1.133.1±0.5697.3±1.062.0±0.39106.0±1.101.5±0.17114.5±0.740.9±0.14132.6±0.510.7±0.10161.3±0.220.1±0.02181.0±0.17—200.5±0.09—220.4±0.06—240.1±0.01—26——

2.3 雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留的消除規(guī)律

高劑量組，磺胺間甲氧嘧啶在前4 d消除較快，殘留量下降了98%以上；低劑量組，磺胺間甲氧嘧啶在前2 d消除較快，殘留量下降了97%以上。經(jīng)測(cè)算：高劑量組的消除速率常數(shù)(k)為0.4 μg·kg-1·d-1，t1/2為1.9 d；低劑量組的消除速率常數(shù)(k)為0.6 μg·kg-1·d-1，t1/2為1.2 d。在不同的給藥劑量下，雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶的消除速率常數(shù)和半衰期不同，這可能是由于不同劑量的磺胺間甲氧嘧啶對(duì)動(dòng)物體肝藥酶系統(tǒng)活性產(chǎn)生了影響，或者可能是因?yàn)椴煌瑒┝康幕前烽g甲氧嘧啶在雞蛋中的藥動(dòng)學(xué)行為呈某種線性關(guān)系，如劉曉暉等[8]在大鼠體內(nèi)進(jìn)行不同劑量紅景天苷的研究中發(fā)現(xiàn)，劑量與藥動(dòng)學(xué)行為有線性關(guān)系。相關(guān)原因還須進(jìn)一步分析確認(rèn)。

3 討論

本研究利用QuEChERS方法進(jìn)行前處理，建立了UPLC-MS/MS測(cè)定雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單，提取效果和穩(wěn)定性良好，適用于大批量樣品的檢測(cè)分析，可為雞蛋中磺胺類藥物的殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供方法借鑒。利用該方法通過蛋雞投藥模擬試驗(yàn)對(duì)雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留消除規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明，高劑量投藥組雞蛋磺胺間甲氧嘧啶的半衰期長(zhǎng)于低劑量組，低劑量投藥組雞蛋磺胺間甲氧嘧啶的消除速率快于高劑量組。為確保雞蛋產(chǎn)品的質(zhì)量安全：若參照原農(nóng)業(yè)部相關(guān)規(guī)定，本試驗(yàn)劑量下的安全休藥期建議為5 d以上；若參照本試驗(yàn)方法最低檢測(cè)限，建議休藥期在25 d以上。

目前，QuEChERS[11]方法已廣泛應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品的前處理中。Wen等[12]在5.0 g樣品中加入15 mL含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈溶液，結(jié)合分散固相萃取(dSPE)對(duì)多種動(dòng)物組織(牛肉、豬肉、雞肉、牛肚和豬肝)中磺胺類藥物進(jìn)行提取，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定，取得了良好的結(jié)果，樣品回收率為74.0%～100.3%，檢測(cè)限為0.01～12.5 μg·kg-1，精確度為0.4%～10.5%。該方法可應(yīng)用于脂肪含量較高的生物樣品，但還未在雞蛋樣品中進(jìn)行過驗(yàn)證。Huertas-Pérez等[13]采用QuEChERS前處理方法對(duì)雞肉和雞蛋中多種抗生素類藥物進(jìn)行提取，稱取5.0 g樣品加入5 mL水和10 mL含有1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈溶液，離心后取3 mL液體至Z-Sep凈化管中，氮吹定容，以液相色譜法(HPLC)測(cè)定，回收率為65.0%～88.1%，定量限為14～85 μg·kg-1。本研究在QuEChERS方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了稱樣量，采用通用的凈化材料，建立了適用于雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶的測(cè)定方法。與上述2種方法相比，本試驗(yàn)方法的回收率更高，靈敏度更高。這主要是因?yàn)楸驹囼?yàn)操作步驟少，減少了提取凈化過程中的損失，且使用的UPLC-MS/MS儀器靈敏度高。