陳 炫，張?zhí)鞜睿?健，張恒木，陳劍平，*

(1.浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021)

真核翻譯延伸因子(eukaryotic translation elongation factor，eEFs)最早作為一個對噬菌體Qβ的依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)活性具有重要作用的輔助因子被發(fā)現(xiàn)并鑒定[1]。在真核細胞中包括3類延伸因子，分別為eEF1α(eukaryotic translation elongation factor 1α)、eEF1β和eEF2[2]。EF1β在真核生物中的結(jié)構(gòu)比在細菌中更復雜，該蛋白由EF1β-alpha、EF1β-gamma和EF1β-beta三個亞基組成。在蛋白質(zhì)的合成過程中，eEF1β主要作為EF家族的一種核苷酸交換因子，催化不活躍的eEF1α·GDP重新變成具有活性的eEF1α·GTP[3]。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，eEFs作為蛋白分子伴侶和RNA/actin結(jié)合蛋白參與病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯、組裝及其致病機理的過程[4-9]。已經(jīng)報道的有eEF1α在番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)[10]和番茄叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)[11]中促進病毒復制復合體的形成；在人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒中促進病毒粒子的組裝[19]；在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)中作為X蛋白的分子伴侶[12]；eEF1β與煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的RdRp互作影響其病毒的復制[13]等。

中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)是本實驗室于20世紀末在我國山東冬小麥上鑒定的一種由禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)傳播的病毒[14]。CWMV為單鏈正義RNA病毒(positive-sense single-stranded RNA virus，(+)ssRNA virus)，包含兩條基因組分別命名為RNA1和RNA2。RNA1含有3個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中ORF1編碼一個149～153 ku的多肽，其UGA終止密碼子能以一定比例通讀(read through，RT)而使開放閱讀框延伸至ORF2，產(chǎn)生一個RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)。ORF3編碼一個36～37 ku的運動蛋白(movement protein，MP)[15]。RNA2含有3個ORF，分別編碼19 ku的CP蛋白、84 ku的外殼蛋白基因通讀區(qū)(CP-RT)蛋白、25 ku的蛋白質(zhì)(N-CP)和18～19 ku的沉默抑制子蛋白[16]。前期本實驗室通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，CWMV侵染小麥初期能夠誘導TaeEF1β在蛋白質(zhì)水平的上調(diào)表達(數(shù)據(jù)待發(fā)表)，據(jù)此，推測TaeEF1β可能通過某種途徑參與病毒侵染寄主植物的過程。本研究首先用RT-PCR從小麥(TriticumaestivumL.)中克隆TaeEF1β基因，并對其進行生物信息學分析，并采用qRT-PCR分析TaeEF1β在小麥根、莖、葉等不同組織部位和CWMV不同侵染時期的轉(zhuǎn)錄表達水平，為進一步研究TaeEF1β對CWMV的影響機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用小麥煙農(nóng)22由山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院提供，并由本實驗室于溫室內(nèi)培養(yǎng)。大腸埃希菌(Escherichiacoil)感受態(tài)細胞Trans 5α購于北京全式金生物技術有限公司；基因克隆所使用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit購于TOYOBO公司；ExTaq酶購于TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶購于New England Biolabs(NEB)公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)所用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR與ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購于南京諾唯贊生物科技公司；凝膠回收GeneJET Gel Extraction Kit購于Thermo Scientific公司；引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

總RNA的提?。喝〗】敌←溔~片0.75 g，使用液氮進行研磨后裝入1.5 mL RNase free EP管(以下步驟均使用RNase free EP管)；按照1 g·mL-1的量加入750 μL TRIzol，渦旋振蕩混勻后于4 ℃，1 4000 r·min-1，離心10 min；小心吸取上清到新的EP管中，按每1 mL TRIzol加入200 μL氯仿，渦旋振蕩混勻后于室溫靜置10 min，4 ℃，1 4000 r·min-1，離心10 min；吸取上清無色水相，按每1 mL TRIzol加入600 μL異戊醇，渦旋振蕩混勻后于室溫靜置10 min，4 ℃，1 4000 r·min-1，離心10 min；棄上清后，用預冷的無水乙醇懸浮沉淀(RNA)后于4 ℃，1 4000 r·min-1，離心10 min(重復該步驟一次)；對RNA進行微干燥后，使用30～50 μL DEPC水進行溶解，用RNA瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One對RNA的完整性、濃度和純度進行檢測，于-80 ℃保存。

cDNA合成：取總RNA 1 μg，以隨機引物為反轉(zhuǎn)錄引物，采用First Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄，反應液配置及反應體系參照試劑盒說明書，進行反轉(zhuǎn)錄獲得小麥cDNA，以0.1×cDNA為PCR擴增模板。

1.3 qRT-PCR

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小麥eEF1β序列(登錄號：AK332529.1)，設計小麥基因TaeEF1β的PCR引物(表1)。使用諾唯贊公司的SYBR在熒光定量儀PCR-7900(ABI)上進行qRT-PCR反應，

表1本實驗所用引物

Table1Primers used in this study

引物名稱Primer name序列Sequence(5'→3')CDC-FCAAATACGCCATCAGGGAGAACATCCDC-RCGCTGCCGAAACCACGAGACTaeEF1β-NAAGGAAGTTTAAATGGCGGCTACCT-TCAATGTTTaeEF1β-CTTGGTGGTGGTGGCAGAAGATT-TAGATTTTGTTGAA

反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s(10 μL體系，40次循環(huán))。以CDC基因為內(nèi)參基因。

1.4 小麥TaeEF1β基因的克隆

以0.1×cDNA為擴增模板，使用引物TaeEF1β-N/TaeEF1β-C進行PCR擴增，反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min(20 μL體系，35次循環(huán))，最后，72 ℃徹底延伸10 min。取10×上樣緩沖液2 μL與PCR反應液混勻后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測電壓為160～180 V，溴酚藍遷移至大約2/3處停止電泳，在凝膠成像儀中UVP光下，將與預期大小一致的凝膠條帶切下，參照Thermo Scientific公司的GeneJET Gel Extraction Kit說明書進行回收。檢測用瓊脂糖凝膠濃度為1.2%，電泳緩沖液為0.5×TAE。純化后的PCR產(chǎn)物連接于T5-zero載體，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌Trans 5α感受態(tài)中，取菌液PCR鑒定結(jié)果正確的樣品送杭州博尚公司進行測序驗證。

1.5 序列分析及其結(jié)構(gòu)分析

測序結(jié)果通過NCBI進行序列比對后，利用Psipred對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測，利用Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/show-motifs.pl)分析該蛋白的結(jié)構(gòu)特征，利用Swiss-model 分子建模服務系統(tǒng)(http://www.swiss-model.expasy.org/)預測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥eEF1β基因的克隆

以構(gòu)建的小麥cDNA文庫為模板，參考NCBI數(shù)據(jù)庫中小麥eEF1β基因序列(基因登錄號：AK332529.1)，設計針對該基因的ORF區(qū)域的PCR引物，進行RT-PCR擴增。PCR擴增獲得的產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于780 bp處獲得一條與預計大小相符的特異性條帶(圖1)。經(jīng)切膠純化回收后，連接至T5-zero載體，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌Trans 5α感受態(tài)細胞中，將陽性菌液送至杭州鉑尚公司進行測序驗證。

2.2 小麥TaeEF1β同源序列的分析

利用獲得的TaeEF1β基因的ORF氨基酸序列，用BLAST在NCBI搜索，顯示該蛋白在水稻(Oryzasativa)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、煙草(Nicotianabenthamiana)等5個物種中也存在高度同源的類似蛋白，其在NCBI中的登錄號分別為：XP_015647859.1(OseEF1β)、CAB90214.1(BaeEF1β)、NP_001149263.1(ZmeEF1β)、XP_002463179.1(SbeEF1β)和NP_001312454.1(NbeEF1β)。利用DNAMAN軟件將TaeEF1β與5個物種間的氨基酸序列進行同源性分析，比對結(jié)果顯示，這些不同物種間的eEF1β的氨基酸序列同源性高達84%(圖2)，其中TaeEF1β與BaeEF1β的氨基酸序列相似性最高，達到99%。用Smart軟件分析該蛋白的結(jié)構(gòu)特征(圖3-A)與保守結(jié)構(gòu)域(圖3-B)，并利用Swiss-model分子建模服務系統(tǒng)預測蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)(圖3-C)，結(jié)果顯示，該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域為137～226 aa。

2.3 qRT-PCR分析TaeEF1β的表達差異性

實驗利用qRT-PCR對TaeEF1β基因在根、莖、葉組織部位中轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量進行分析，如圖4-A所示。以TaeEF1β在根部的表達量為參照，結(jié)果顯示，TaeEF1β在莖部的表達量最高，

1，8 000 bp DNA Ladder；2，TaeEF1β.圖1 TaeEF1β的基因的RT-PCR擴增Fig.1 TaeEF1β obtained by RT-PCR

圖2 TaeEF1β的氨基酸同源序列分析Fig.2 Homology analysis of TaeEF1β

根部和葉部的表達量次之，且兩者的表達量相對一致。該結(jié)果也表明，雖然TaeEF1β基因在小麥的根、莖、葉組織部位中都存在表達，但是具有一定的組織表達特異性。

eEF1β參與多種RNA病毒的復制過程[1]。為了驗證在CWMV侵染前后TaeEF1β轉(zhuǎn)錄水平的表達量變化，本實驗利用qRT-PCR對TaeEF1β基因在CWMV侵染小麥植株4、6、8和10 d的轉(zhuǎn)錄水平表達量進行分析，如圖4-B所示。結(jié)果表明，CWMV的侵染可以明顯誘導TaeEF1β的表達，其中4 d的表達量最高，上調(diào)12.3倍，6、8和10 d的表達量也顯示出上調(diào)趨勢，但相對較為一致，分別為6.3倍、6.1倍和6.5倍。該結(jié)果也進一步說明，TaeEF1β的表達量受CWMV侵染的誘導，且在病毒的侵染初期最為明顯，因此TaeEF1β可能參與CWMV的復制過程。

3 討論

eEF是一類多功能調(diào)控蛋白，廣泛參與植物的各種生命過程，有關eEF生物學功能的證據(jù)主要來自于酵母[8，17]和哺乳動物[18-19]，對于植物eEF

A： ：α-螺旋； ：β-折疊； ：無規(guī)則卷曲；B： ：(137-226aa)保守結(jié)構(gòu)域A： ：helix； ：strand； ：coli；B： ：The conservative structure domain of (137-226aa)圖3 TaeEF1β的二級結(jié)構(gòu)(A)、保守結(jié)構(gòu)域的預測(B)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型(C)Fig.3 Secondary structure of TaeEF1β (A)， conservative structural domain prediction (B) and protein structure model of TaeEF1β (C)

圖4 TaeEF1β在小麥不同部位(A)及CWMV不同侵染時期(B)的表達分析Fig.4 Relative expression level of TaeEF1β in different tissues (A) and different stages of CWMV infection (B) of wheat

的生物學功能和作用機制知之甚少。因此，對于植物eEF類蛋白的研究還有待進一步深入。本研究成功地克隆了小麥的TaeEF1β基因，同源分析表明，該蛋白與水稻、大麥、玉米、高粱和煙草植株中的EF1β高度同源，推測TaeEF1β與其他植物中的同源蛋白可能存在相同的功能。蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域和三維預測分析表明，TaeEF1β的保守結(jié)構(gòu)域主要位于137～226 aa處，這也為后期該蛋白的功能分析奠定基礎。

植物不同營養(yǎng)組織、不同的發(fā)育時期需要不同蛋白參與調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，TaeEF1β在小麥的根、莖、葉組織部位中都存在表達，且莖部的表達量最高。因此，推測TaeEF1β可能主要參與植物的莖部生長發(fā)育過程。eEF1β作為植物中重要的蛋白，也參與病毒生活史的循環(huán)過程。如NbeEF1β與煙草花葉病毒(TMV)的RdRp蛋白互作，從而有利于TMV在煙草植株中的復制過程[13]。另外，eEF1β還能與eEF的另外一個組成蛋白eEF1A蛋白發(fā)生直接互作從而影響eEF1A的活性。眾所周之，eEF1A廣泛的參與病毒的生命過程，如eEF1A參與正鏈RNA病毒復制，如登革熱病毒(dengue virus，DV)[20]、黃蘿卜花葉病病毒(Turnipyellowmosaicvirus，TYMV)[21]、煙草花葉病毒(TMV)[22]、西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)[23]和蕪菁皺縮病毒(Turnipcrinklevirus，TCV)[16]；也有報道表明其參與負鏈RNA病毒如水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)的復制[24]。本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)在CWMV侵染的初期TaeEF1β在轉(zhuǎn)錄水平的表達量呈現(xiàn)明顯上調(diào)，這也預示該蛋白可能與CWMV的初期復制相關，但是其是直接參與病毒的復制還是通過影響eEF1A的活性從而參與病毒的復制過程仍有待進一步研究。