楊帆平，李國(guó)文，奚 燕

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室，上海 200062；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200082；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科，上海 200032)

咳喘六味合劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，結(jié)合臨床實(shí)踐，將麻黃、附子、黃芩、細(xì)辛、桃仁和虎耳草配制而成的院內(nèi)制劑，該藥溫陽(yáng)抗寒、化痰平喘，主要用于虛寒型或是寒邪較盛的咳喘治療。哮喘屬于中醫(yī)“哮病”范疇，長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)表明，中醫(yī)藥在治療哮喘方面具有優(yōu)勢(shì)，本方較好地體現(xiàn)了祖國(guó)醫(yī)學(xué)“治病求本”的思想[1]。

咳喘六味合劑適用于腎陽(yáng)虛哮喘患者，臨床療效顯著[2]，但是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂時(shí)間較早，且僅針對(duì)麻黃一種藥味進(jìn)行了定性鑒別，對(duì)外觀、pH值等檢查項(xiàng)缺少有效的含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)增加了咳喘六味合劑中的黃芩、細(xì)辛的薄層色譜(TLC)鑒別方法，新建了麻黃、黃芩的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，為提高和完善咳喘六味合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了可靠依據(jù)。

1 儀器和試藥

Sartorius BS110S分析天平(萬(wàn)分之一級(jí))；Sartorius CP225D分析天平(十萬(wàn)分之一級(jí))；硅膠G薄層預(yù)制板(青島海洋化工廠(chǎng))；其余試劑均為分析純；對(duì)照品：黃芩苷(批號(hào)：110715-201318),黃芩素(批號(hào)：111595-201607)，漢黃芩素(批號(hào)：111514-201605)，細(xì)辛脂素(批號(hào)：111889-201504)，鹽酸麻黃堿(批號(hào)：171241-201508)，鹽酸偽麻黃堿(批號(hào)：171237-201509)，黃芩中藥材(批號(hào)：120955-201309)，細(xì)辛中藥材(批號(hào)：121204-201405)，以上對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供?？却逗蟿┕┰嚻?批號(hào)：160918)，龍華醫(yī)院制劑室。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩的薄層鑒別

2.1.1供試品溶液的制備

精密量取咳喘六味合劑5 ml置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)30 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.2對(duì)照藥材溶液的制備

取黃芩對(duì)照藥材0.5 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)30 ml，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。

2.1.3對(duì)照品溶液的制備

取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品，加甲醇溶解，制成每1 ml含1 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.4陰性樣品溶液的制備

取除黃芩藥材外的其他五味藥材按相同處方配比和工藝制備陰性樣品，取5 ml，再按“2.1.1”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.1.5薄層條件和結(jié)果

按照TLC法[3](《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性樣品溶液各2 μl以及對(duì)照品溶液1 μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，以甲苯-乙酸丁酯-甲醇-甲酸 (10∶3∶1∶2)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果如圖1所示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯3個(gè)相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性樣品溶液對(duì)結(jié)果沒(méi)有影響。說(shuō)明本方法可用于鑒別咳喘六味合劑中的黃芩。

圖1 黃芩薄層鑒別圖1.黃芩苷；2.黃芩素；3.漢黃芩素；4.黃芩對(duì)照藥材；5.供試品；6.陰性樣品

2.2 細(xì)辛的薄層鑒別[4]

2.2.1供試品溶液的制備

取咳喘六味合劑10 ml，加甲醇50 ml，加熱回流30 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，加石油醚(60～90 ℃)振搖提取2次，每次20 ml，合并石油醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?.5 ml，使溶解，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2對(duì)照藥材溶液的制備

取細(xì)辛對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇50 ml，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制得對(duì)照藥材溶液。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取細(xì)辛脂素對(duì)照品，加甲醇溶解制成每1 ml含1 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.4陰性樣品溶液的制備

取除細(xì)辛藥材外的其他五味藥材，按相同處方配比和工藝制備陰性樣品，取10 ml，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.2.5薄層條件和結(jié)果

按照TLC法[3]實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各15 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(16∶3∶4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果如圖2所示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品溶液對(duì)結(jié)果無(wú)影響。說(shuō)明本方法可用于鑒別咳喘六味合劑中的細(xì)辛。

圖2 細(xì)辛薄層鑒別圖1.細(xì)辛脂素；2.對(duì)照藥材；3.陰性樣品；4.供試品

2.3 麻黃的含量測(cè)定[5]

2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液(4∶96)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm；流速1.0 ml/min。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于7 000。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品15 mg，精密稱(chēng)定置于50 ml量瓶中，甲醇使之溶解，定容至刻度，搖勻；另精密稱(chēng)定鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品25 mg，以同法制成溶液；分別精密量取上述溶液5、2 ml，置同一25 ml量瓶中，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(4∶96)，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3供試品溶液的制備

精密量取咳喘六味合劑2 ml，置分液漏斗中，加水10 ml及濃氨試液1 ml，搖勻，乙醚液振搖提取3次，每次30 ml，合并乙醚液，加5%鹽酸甲醇溶液5 ml，搖勻，40 ℃回收溶劑至干，殘?jiān)由鲜隽鲃?dòng)相溶解，并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4陰性樣品溶液的制備

取按處方去除麻黃制得的陰性樣品2 ml，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.3.5專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)選用的色譜條件下，供試品與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間出峰，陰性樣品溶液對(duì)鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的測(cè)定無(wú)干擾(圖3)。

圖3 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿HPLC圖A.對(duì)照品；B.陰性樣品；C.供試品；1.鹽酸麻黃堿;2.鹽酸偽麻黃堿

2.3.6線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密稱(chēng)取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品15.05、9.97 mg，置同一50 ml量瓶中，加上述流動(dòng)相溶解，稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述混合溶液2、5、10、25 ml，分別置50 ml量瓶中，加上述流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取制得的溶液及母液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。結(jié)果顯示，鹽酸麻黃堿在12.04～301.00 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=23.519 8X-10.400 8，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0；鹽酸偽麻黃堿在7.98～199.40 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=23.986 4X-8.284 7，r=1.000 0。

2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備供試品溶液，分別在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、8、12、24 h)測(cè)定峰面積，每次精密吸取10 μl進(jìn)樣。結(jié)果得到鹽酸麻黃堿在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的峰面積積分值RSD為0.2%，鹽酸偽麻黃堿的RSD為1.3%，說(shuō)明咳喘六味合劑在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8重復(fù)性試驗(yàn)

制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定含量，結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的平均含量分別為0.84 mg/ml和0.62 mg/ml，RSD分別為0.11%和0.92%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好。

分別由兩人各自配制相同濃度的供試品溶液6份，通過(guò)不同的儀器和試劑，計(jì)算12個(gè)含量數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果得到鹽酸麻黃堿含量的RSD為0.21%，鹽酸偽麻黃堿含量的RSD為1.1%，表明試驗(yàn)符合要求。

2.3.9回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品18.32、15.07 mg，置同一50 ml量瓶中，用上述流動(dòng)相溶解，稀釋至刻度，混勻，備用；精密量取咳喘六味合劑1 ml，共9份，置分液漏斗中，分別加入上述配制好的對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 ml，平行3份，分別加水10 ml及濃氨試液1 ml，搖勻，乙醚液振搖提取3次，每次30 ml，合并乙醚液，加5%鹽酸甲醇溶液5 ml，混勻，40 ℃回收溶劑至干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得；計(jì)算回收率得到，鹽酸麻黃堿平均回收率為101.7%，RSD為1.5%；鹽酸偽麻黃堿平均回收率為101.6%，RSD為2.4%，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度高，回收率較好。

2.4 黃芩的含量測(cè)定

2.4.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%磷酸溶液(47∶53)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；流速1.0 ml/min。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于5 000。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備

取黃芩苷對(duì)照品15 mg，精密稱(chēng)定，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3供試品溶液的制備

精密量取咳喘六味合劑5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4.4陰性樣品溶液的制備

取按處方去除黃芩制得的陰性樣品5 ml，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.4.5專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)選用的色譜條件下，供試品與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間出峰，陰性樣品溶液對(duì)黃芩苷的測(cè)定無(wú)影響(圖4)。

圖4 黃芩苷HPLC圖A.對(duì)照品；B.陰性樣品；C.供試品；1.黃芩苷

2.4.6線(xiàn)性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品13.88 mg，置50 ml量瓶中，甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1、2、3、5、6、10 ml，分別置50 ml量瓶中，用流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液(47∶53)稀釋至刻度，搖勻。以上溶液及母液各精密吸取10 μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定。以黃芩苷對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。結(jié)果顯示黃芩苷在5.18～129.50 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=39.015 1X-15.643 9，r=0.999 9。

2.4.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備供試品溶液，分別在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、8、12、18、24 h)測(cè)定峰面積，每次精密吸取10 μl進(jìn)樣。結(jié)果得到7個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的峰面積積分值RSD為0.4%，表明咳喘六味合劑在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8重復(fù)性試驗(yàn)

制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl。通過(guò)計(jì)算得到，黃芩苷的平均含量為9.0 mg/ml，RSD為1.0%，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

分別由兩人各自配制相同濃度的供試品溶液6份，通過(guò)不同的儀器和試劑，計(jì)算12個(gè)含量數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果得到樣品含量的RSD為1.3%，表明試驗(yàn)符合要求。

2.4.9回收率試驗(yàn)

精密量取咳喘六味合劑2.5 ml，共9份，分別置于50 ml量瓶中，以3份為一組，每組分別加入黃芩苷對(duì)照品約18、 22.5、27 mg，甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。計(jì)算平均回收率為101.0%，RSD為0.3%，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度較高。

3 討論

咳喘六味合劑中的附子是一味常用的溫里藥，生藥材使用前需經(jīng)炮制減毒，其含有的主要成分可為單酯型和雙酯型生物堿。筆者嘗試用HPLC法對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定，但陰性樣品干擾較大，不能準(zhǔn)確控制其含量，后續(xù)將對(duì)此開(kāi)展研究?；⒍輰儆诿褡遽t(yī)藥，未被《中國(guó)藥典》收載，只收錄于貴州省地方藥材標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)其乙醇提取物中含有多元酚、黃酮、有機(jī)酸等[6]多種成分，但由于研究時(shí)間較短，需要進(jìn)一步探索其活性部位的活性成分。

展開(kāi)劑的選擇對(duì)TLC中待鑒別成分的分離效果至關(guān)重要。對(duì)咳喘六味合劑中的桃仁，筆者曾嘗試以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10 ℃放置12 h的下層溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行TLC研究，但無(wú)論是日光還是熒光下，都未能在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯示相同顏色斑點(diǎn)。而在對(duì)細(xì)辛的鑒別過(guò)程中，筆者采取了兩種不同的方法，其中，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)為展開(kāi)劑的方法未能成功分離得到滿(mǎn)意的結(jié)果。

對(duì)于麻黃中主要藥效成分的含量測(cè)定，《中國(guó)藥典》(2015年版)標(biāo)明的測(cè)定方法中，色譜柱為乙醚鍵合硅膠C18柱，而本實(shí)驗(yàn)選用了常規(guī)的C18柱對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的分離度均大于2.0，理論塔板數(shù)超過(guò)10 000，比藥典方法更加簡(jiǎn)便易行。

在黃芩苷含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于流動(dòng)相的選擇，首先參照《中國(guó)藥典》(2015年版)中【黃芩】項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，然后根據(jù)系統(tǒng)適用性要求調(diào)整流動(dòng)相比例，當(dāng)甲醇與0.1%磷酸的比例為47∶53時(shí)，色譜峰分離度較好，理論塔板數(shù)高。