錢俞君, 秦春霞, 孫莉莉, 丁華敏, 李鐵軍

(上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院藥劑科,上海 200125)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是多種心腦血管疾病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，主要發(fā)病機制包括血管內(nèi)皮損傷、慢性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、泡沫細(xì)胞形成等[1]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)與缺氧、炎癥、泡沫細(xì)胞形成、氧化應(yīng)激等眾多AS致病因素密切關(guān)聯(lián)，提示HIF-1可能是AS發(fā)生發(fā)展的重要靶標(biāo)和開發(fā)防治AS的藥物新靶點。本研究將建立一個以熒光素酶活性檢測反映HIF-1α活性變化為觀測指標(biāo)，高通量篩選抗AS先導(dǎo)化合物的體外細(xì)胞模型，并通過陽性藥洛伐他汀及姜黃素的抗HIF-1α活性檢測分析對該模型進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

人單核巨噬細(xì)胞系U937和THP-1系購自上海中科院細(xì)胞所；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol等(Invitrogen公司)；pGL3-Enhancer熒光素酶表達載體、雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA制備試劑盒購自Qiagen公司；蛋白一抗及二抗(Abcam公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)，定量PCR儀及配套檢測試劑盒(Takara公司)；DNA合成及測序在上海Invitrogen公司完成，洛伐他汀和姜黃素購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1載體構(gòu)建

文獻查閱HRE核心序列信息為5′-(A/G)CGT (G/C) C-3′，根據(jù)核心序列，設(shè)計長鏈互補雙鏈引物，為核心序列的7組重復(fù)序列，引物兩端添加KpnI和XhoI酶切位點及保護堿基。上游引物：5′-GGGGTACCACGTGCACGTGC ACGTGCACGTGCACGTGCACGTGCACGTGCCGG-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGGCACGTGCACGTGCACGT GCACGTGCACGTGCACGTGCACGTCC-3′。引物設(shè)計完成之后，按照Page級進行合成。后將雙鏈DNA稀釋退火形成雙鏈DNA，克隆至線性化的表達載體pGL3-Enhancer，構(gòu)建熒光素酶重組表達載體pGL3-HIF-1α。重組載體經(jīng)過序列分析確認(rèn)無誤后，擴增轉(zhuǎn)化菌株，使用Qiagen的無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提試劑盒制備無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及工具細(xì)胞株篩選

取對數(shù)生長期U937和THP-1細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基(RPMI-1640+10%FBS)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml，將細(xì)胞接種到6孔板，每孔添加2 ml細(xì)胞懸液，37 ℃和5%CO2濃度下培養(yǎng)24 h，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmaine 2000說明書進行pcDNA-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染后72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3穩(wěn)定表達細(xì)胞株篩選

以轉(zhuǎn)染效率高的THP-1細(xì)胞進行穩(wěn)定表達細(xì)胞株篩選試驗。將THP-1細(xì)胞(1×105個/ml)接種到6孔板培養(yǎng)24 h后，進行pGL3-HIF-1α-HRE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，使用臺酚藍進行活細(xì)胞染色，制備細(xì)胞懸液(10個/ml)后接種細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，正常條件(37 ℃和5%CO2)繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液，培養(yǎng)至第9天。倒置顯微鏡下觀察，選擇細(xì)胞形態(tài)均一的6個細(xì)胞克隆(標(biāo)記為C1～C6)后轉(zhuǎn)移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，再放大培養(yǎng)至12孔板，直至6孔板和10 cm培養(yǎng)皿。然后通過基因篩查的方法對其中的克隆片段HIF-1α-HRE進行定量，根據(jù)檢測結(jié)果選取其中1株克隆進行后續(xù)實驗。

1.2.4RealTime-PCR檢測細(xì)胞克隆中HRE相對含量

取對數(shù)生長期的6組克隆細(xì)胞各1×106個，按照Trizol說明書，提取細(xì)胞總RNA，使用通用反轉(zhuǎn)錄引物Random9并參照試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，然后進行定量PCR反應(yīng)。檢測引物序列：β-actin上游引物：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′,β-actin下游引物：5′-CGACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3′; HRE上游引物：5′-GGGGTACCACGTGCACGTGCA-3′, HRE下游引物：5′-CCGGCACGTGCACGTGCACGTGCA-3′，β-actin為內(nèi)參使用。PCR的反應(yīng)總體系為20 μl：SYBR Premix Ex Tap 10 μl，上下游引物(20 μmol/L)各0.2 μl，cDNA 2 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；60 ℃，20 min；72 ℃，20 min，反應(yīng)設(shè)置為40個循環(huán)。通過擴增曲線與閾值線的交點來計算每組樣本的Ct值，目的基因相對于內(nèi)參基因的表達量為2ΔΔCt。根據(jù)定量結(jié)果，選取HRE表達最高的一株細(xì)胞克隆，命名為THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase進行后續(xù)實驗。

1.2.5熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

取對數(shù)生長期THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，正常條件培養(yǎng)24 h，使用完全培養(yǎng)基進行全量換液，同時添加洛伐他汀(10 μmol/L)和姜黃素(1、2和10 μmol/L)，正常條件培養(yǎng)2 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入低氧條件(95% N2和5% CO2)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。而后收集細(xì)胞，分別檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性和HIF-1α蛋白表達。

1.2.6免疫印跡法檢測HIF-1α蛋白表達

離心法收集待測細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度。每組樣本取11 μl進行10% SDS-PAGE垂直電泳，濕法將膠中蛋白水平轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶常溫封閉2 h，加入TBST稀釋后的一抗(HIF-1α一抗，1∶500，β-actin一抗，1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；取出后TBST洗膜3次再加入二抗(羊抗鼠二抗，1∶3 000稀釋)，孵育2 h，再洗膜3次，添加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物，進行X光曝片，目的條帶經(jīng)掃描后通過光密度分析軟件進行分析，Twist蛋白相對含量=目的條帶的光密度值/β-actin條帶的光密度值。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 pGL3-HIF-1α-HRE表達載體構(gòu)建

載體經(jīng)序列分析(圖1)，插入HRE序列與設(shè)計序列完全一致。

2.2 工具細(xì)胞株篩選

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后72 h，筆者發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(GFP表達細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例)遠遠大于U937(圖2)。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是穩(wěn)定表達細(xì)胞株篩選和建立的前提。同時，THP-1細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞大小形態(tài)更為均一，因此，選擇THP-1進行后續(xù)穩(wěn)定表達細(xì)胞株的篩選，即工具細(xì)胞株建立。

圖2 U937和THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測A、C.為可見光下拍照；B、D.為相同視野下的可見光視野

2.3 細(xì)胞克隆鑒定

通過熒光定量的方法對形態(tài)學(xué)初步篩選的6組克隆細(xì)胞(C1～C6)中外源基因HIF-1α-HRE序列做了定量分析以選擇高質(zhì)量細(xì)胞進行克隆。結(jié)果(圖3)表明，6組克隆細(xì)胞中均有外源基因HIF-1α-HRE檢出，其中C1克隆的外源基因相對含量最低，C2最高。與C1比較，C2、C4和C5組克隆HIF-1α-HRE相對含量均明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，選擇C2號克隆(命名為THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase)進行后續(xù)實驗。

圖3 HIF-1α-HRE的定量檢測*P<0.05，**P<0.01， 與C1組比較A.HIF-1α-HRE相對含量的組間差異分析；B.Realtime-PCR檢測原始曲線

2.4 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞的熒光素酶活性檢測

THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase經(jīng)24 h低氧培養(yǎng)，與溶媒對照組比較，胞內(nèi)熒光素酶活性明顯增強(P<0.01)。洛伐他汀(10 μmol/L)預(yù)處理2 h，可以有效抑制低氧引起的THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞熒光素酶升高，與低氧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。姜黃素(1、2和10 μmol/L)預(yù)處理也可有效抑制低氧引起的熒光素酶升高，其中2 μmol/L和10 μmol/L預(yù)處理組與低氧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞熒光素酶活性檢測*P<0.05，**P<0.01，與低氧組比較

2.5 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達檢測

低氧培養(yǎng)24 h能夠明顯增強THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達，與溶媒組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。洛伐他汀(10 μmol/L)和姜黃素(1、2和10 μmol/L)均可抑制低氧引起的THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達增強，與低氧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 )。結(jié)果與熒光素酶活性的結(jié)果相一致(圖5)。

圖5 免疫印跡檢測THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細(xì)胞HIF-1α蛋白表達*P<0.05，**P<0.01，與低氧組比較

3 討論

AS是一個由動脈血管壁粥樣斑塊進行性積聚，最終導(dǎo)致局灶性動脈阻塞的病理過程。天然物質(zhì)中尤其是中藥中有許多成分如黃酮類，通過抗氧化作用抑制泡沫細(xì)胞形成和AS的發(fā)生[2]。從中藥及其提取物、單體成分中篩選抑制泡沫細(xì)胞形成的活性成分可能是一條可行的便捷途徑，因此建立高通量和特異的篩選模型是十分重要的課題。報告基因法篩藥模型就是針對靶基因表達調(diào)控發(fā)展起來的功能性新藥高通量篩選方法，即將靶基因表達的調(diào)控序列與編碼某些酶活性(如熒光素酶)的基因相連，轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，通過簡單地檢測酶活性(如熒光強度)變化，來反映化合物對轉(zhuǎn)錄因子和靶基因表達的作用性質(zhì)和強度。

HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α蛋白是HIF-1DNA結(jié)合活性的主要決定因素，通過與HRE結(jié)合調(diào)控相應(yīng)基因的表達。HIF-1在缺氧適應(yīng)和許多病理過程中(如腫瘤、心肌缺血、肺動脈高壓和慢性阻塞性肺疾病等)起重要作用[3]。研究表明缺氧在AS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而HIF-1是缺氧誘導(dǎo)基因表達的中心調(diào)節(jié)子[4-5]。AS是一個慢性炎癥過程[1]，包括細(xì)胞因子、黏附分子產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、泡沫細(xì)胞形成等，而HIF-1是炎癥細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。有報道高膽固醇低密度脂蛋白通過誘導(dǎo)HIF-1α高表達促進內(nèi)皮細(xì)胞VEGF和VEGF受體-2過度表達[7]；而維生素C和維生素E等抗氧化劑通過降低HIF-1α表達從而抑制VEGF和VEGF受體-2上調(diào)，是其抗AS的機制之一[8-9]。Shatrov 等[10]報道氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)通過氧化還原調(diào)節(jié)途徑引起人巨噬細(xì)胞HIF-1α蛋白積累。本課題組應(yīng)用體外ox-LDL誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株U937形成泡沫細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)RNA干擾HIF-1α可顯著抑制泡沫細(xì)胞形成，抑制許多AS相關(guān)基因表達[11]。綜上可見，HIF-1α是泡沫細(xì)胞和AS形成的重要靶標(biāo)，針對HIF-1靶點可研發(fā)防治AS的藥物。有報道從天然植物提取物中針對腫瘤細(xì)胞HIF-1α為靶點采用報告基因法篩選了HIF-1抑制物[12]。但未見針對單核細(xì)胞中HIF-1α為靶點的中藥活性成分篩選的報道。

羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑他汀類藥物是臨床上療效確切的調(diào)血脂藥和抗AS藥，目前研究表明他汀類藥物在不降低高脂血癥血漿脂蛋白情況下，可下調(diào)人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞HIF-1表達，減輕冠狀動脈壁缺氧和滋養(yǎng)血管生成[13-14]。芹菜素和姜黃素等天然化合物通過降解HIF-1α抑制VEGF表達從而抑制血管生成[15]。本研究中采用洛伐他汀和姜黃素作為陽性對照藥物，觀察對模型體系中HIF-1α表達的抑制作用。

在本研究中，筆者首先構(gòu)建含人HIF-1啟動子即HRE特定部位和LUC的嵌合體報告基因質(zhì)粒(pGL3-HIF-HRE-Luc)，進而轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞THP-1，通過單細(xì)胞培養(yǎng)法建立穩(wěn)定表達細(xì)胞株THP-1- HIF-1α-HRE-Luc，即高效HIF-1α活性篩選模型。然后通過研究HIF-1α抑制物工具藥洛伐他汀和姜黃素對篩選模型進行功能鑒定。課題組針對泡沫細(xì)胞HIF-1α采用報告基因法建立了高通量細(xì)胞篩藥模型，該模型為研發(fā)防治AS的新藥提供了有利工具。