朱光貞，楊 波，楊 芹，唐 鑫，張 灝，陳永泉，陳海琴，陳 衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

共軛脂肪酸是指含有共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸的位置和幾何異構(gòu)體的總稱[1]。共軛亞麻酸(CLNA)是一組在不同位置(碳8,10,12；碳9,11,13；碳10,12,14；碳11,13,15)、不同構(gòu)型(ttt,ctt,ctc,ccc,tct,ttc等)的十八碳三烯酸的位置和幾何異構(gòu)體[2-3]，具有抗癌、抗炎癥、抗氧化、抗心血管疾病、減肥[4]等生理功能，并且相較于其他共軛脂肪酸，CLNA的生理作用更明顯[5]，同時(shí)共軛三烯脂肪酸有利于聚合和粘貼，在工業(yè)上可以作為有機(jī)涂料聚合物[6]。天然CLNA主要來源于植物種子，極少量來源于動(dòng)物[7-8]。目前，天然CLNA的分離純化方法主要有尿素包合法[9]、超臨界CO2流體萃取法[10]等，將飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸進(jìn)行分離，產(chǎn)物多為結(jié)構(gòu)差異很小的混合物[1,3-4,11]，并且收率低，成本高；工業(yè)制備CLNA的方法主要包括化學(xué)合成法[12]、脫水法[13]、堿異構(gòu)法[8]等，產(chǎn)物多為混合物[4]，制備過程中有機(jī)試劑可能有殘余，而且能耗大、效率低、污染環(huán)境。許多微生物(如瘤胃細(xì)菌、丙酸桿菌、乳酸菌等)可產(chǎn)CLNA，其異構(gòu)體單一，多為碳9,11,15位置的十八碳三烯脂肪酸[14]。其中，瘤胃細(xì)菌(如溶纖維丁酸弧菌)是嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，丙酸桿菌是致病菌，均不能滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要；相比較下，乳酸菌是兼性厭氧細(xì)菌，且近幾年來作為益生菌得到了大眾的普遍認(rèn)可，是故本實(shí)驗(yàn)選擇乳酸菌作為CLNA的代謝菌種。

Suzuki等[8]指出，CLNA的功能與其異構(gòu)體的種類有關(guān)，而乳酸菌所產(chǎn)的CLNA與植物來源、化學(xué)合成的CLNA結(jié)構(gòu)有所不同，因此乳酸菌發(fā)酵液中不同CLNA異構(gòu)體之間的分離顯得尤為重要，又由于CLNA異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)差異很小[3,10]，分離制備的方法成為了制約CLNA異構(gòu)體研究的一大難題。

有文獻(xiàn)指出高效液相色譜法(HPLC)可以用來分離制備乳酸菌發(fā)酵液酯化形式的脂肪酸異構(gòu)體[15]和游離形式的羥基脂肪酸[16]，但是游離態(tài)乳酸菌源CLNA單一異構(gòu)體的分離制備還未有報(bào)道。本文主要通過薄層色譜和高效液相色譜兩種方法，對乳酸菌發(fā)酵液中游離形式CLNA分離制備的方法進(jìn)行了研究，并成功得到了結(jié)構(gòu)單一的CLNA異構(gòu)體，為后續(xù)單一異構(gòu)體的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

植物乳桿菌ZS2058，是本實(shí)驗(yàn)室2004年從四川泡菜中篩選到的一株對共軛脂肪酸具有高轉(zhuǎn)化率的乳酸菌，可以將α-亞麻酸(LNA)轉(zhuǎn)化為3種CLNA，并且轉(zhuǎn)化率高達(dá)83.66%[17]。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：1.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖、0.5%酵母提取物、1%牛肉膏、0.5%乙酸鈉、0.2%檸檬酸二銨、0.1%吐溫80、0.26%K2HPO4·3H2O、0.01%MgSO4·7H2O、0.005%MnSO4·H2O，pH為6.5。

MRS固體培養(yǎng)基為添加1.5%瓊脂的液體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑及儀器

α-亞麻酸(NuChek，純度≥99.9%)，三甲基硅烷化重氮甲烷(上海百靈威有限公司)，甲醇(HPLC級，上海百靈威有限公司)，甲酸(HPLC級，上海阿拉丁試劑有限公司)，乙腈(HPLC級，德國默克公司)，其他試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；此外，薄層層析硅膠制備板購買于乳山市太陽干燥有限公司。

色譜柱Ultimate?(5XB-C30，4.6 mm×250 mm，上海月旭公司)，色譜柱Hypersil(3GOLD-C18，100 mm×2.1 mm，美國賽默飛有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph Digital)，QGC-36T氮吹儀(上海泉島公司)，GC-MS-QP2010 Ultra 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，HPLC-UV-MS-Q Exactive 高相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國賽默飛有限公司)，Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及培養(yǎng)

1.2.1.1 菌株活化

從植物乳桿菌ZS2058保菌管中挑取菌液劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代。

1.2.1.2 菌株培養(yǎng)

將活化好的菌液按1%接種量接種至含0.3 mg/mLα-亞麻酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.2.2 脂肪酸提取

將培養(yǎng)后的菌液按菌液與異丙醇、正己烷體積比為3∶2∶3放入梨形分液漏斗中，振蕩10 min，靜置15 min后取上層正己烷層。上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，用無水甲醇復(fù)溶，至脂肪酸終質(zhì)量濃度約為2 mg/mL。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測

取10 μL樣品，添加十七烷酸(C17∶0)作為內(nèi)標(biāo)至終質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL，氮?dú)獯蹈桑? mL正己烷復(fù)溶，10 000 r/min離心2 min，取上清液，采用Yang等[18]的方法進(jìn)行GC-MS檢測。

1.2.4 薄層色譜法分離CLNA及純度檢測

根據(jù)游離脂肪酸的極性大小，選擇的展開劑為氯仿-甲醇-乙酸。層析缸中提前放入1.0 cm左右高的展開劑，在另一個(gè)層析缸中提前鋪滿一層碘顆粒，使其在層析缸中充分平衡。

分別在距離薄層層析硅膠板上下邊緣1.5 cm處用鉛筆劃線，用毛細(xì)管輕輕在下線點(diǎn)樣。點(diǎn)樣結(jié)束后，放入水平放置的展開劑層析缸中(注意展開劑不要浸泡樣品)，待展開劑展開到上線后，取出硅膠板，晾干后放入碘顆粒層析缸中碘熏染20 min顯色。

待染色結(jié)束，取出硅膠板拍照，并把各部分用刀片刮下，氯仿萃取3次，采用Yang等[18]的方法將其甲酯化后，進(jìn)行GC-MS檢測。

1.2.5 全波長掃描樣品中的脂肪酸

9,11,15-CLNA的最佳紫外吸收波長未有報(bào)道，故利用紫外分光光度計(jì)對植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液進(jìn)行全波長掃描。

1.2.6 高效液相色譜柱的篩選

將HPLC-UV-MS系統(tǒng)串聯(lián)好后，根據(jù)需要，選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相及流速在進(jìn)樣量50 μL、柱溫為常溫條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)色譜圖中的峰圖及質(zhì)譜圖中的離子質(zhì)荷比大小對樣品成分進(jìn)行定性分析。

1.2.7 流動(dòng)相的優(yōu)化

采用HPLC-UV分離制備游離CLNA，在高效液相系統(tǒng)中安裝好色譜柱，設(shè)置流動(dòng)相及流速，紫外波長設(shè)置為全波長掃描中吸收值最大的波長，在進(jìn)樣量50 μL、柱溫為常溫條件下對樣品中的CLNA進(jìn)行分離條件優(yōu)化。

1.2.8 制備產(chǎn)物的純度檢測

將制備得到的CLNA單一異構(gòu)體于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，用無水甲醇復(fù)溶，取10 μL樣品甲酯化[18]后，采用1.2.3中的方法進(jìn)行GC-MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜法分離植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液中的CLNA

在薄層色譜分析條件為展開劑氯仿-甲醇-乙酸(體積比40∶10∶0.01)，上樣量0.15 mg時(shí)，薄層色譜法可將樣品分為3部分(見圖1A)，分別取下3部分脂質(zhì)樣品，從遠(yuǎn)離點(diǎn)樣點(diǎn)處依次為第一、二、三部分脂質(zhì)樣品，經(jīng)萃取、甲酯化后進(jìn)行GC-MS純度檢測，結(jié)果如圖1B、C、D所示。

注：A.植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液中CLNA分離的薄層色譜圖；B.第一部分脂質(zhì)樣品的氣相色譜圖；C.第二部分脂質(zhì)樣品的氣相色譜圖；D.第三部分脂質(zhì)樣品的氣相色譜圖。

圖1植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液中CLNA分離的薄層色譜圖及3部分脂質(zhì)樣品的純度檢測

由圖1可知，在薄層色譜法分離CLNA的最佳分離條件下得到3部分脂質(zhì)樣品，沒有得到CLNA的單一異構(gòu)體，其中摻雜著含量很高的C16∶0和C18∶0，與未進(jìn)行分離的原發(fā)酵液成分相似。文獻(xiàn)報(bào)道薄層色譜法經(jīng)常應(yīng)用于游離態(tài)脂肪酸和酯化形式脂肪酸的分離，但對于每種游離脂肪酸的分離幾乎沒有涉及，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明薄層色譜法無法對乳酸菌源CLNA單一異構(gòu)體進(jìn)行分離，且樣品損失率很高，故在現(xiàn)有條件下薄層色譜法無法滿足本實(shí)驗(yàn)的需求。

2.2 植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液的全波長掃描

有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，HPLC-UV分離制備植物乳桿菌來源羥基脂肪酸時(shí)，紫外波長為205 nm和233 nm，HPLC-UV分離制備植物來源的酯化形式的9,11,13-CLNA時(shí)，紫外吸收波長是235 nm[8]，但是9,11,15-CLNA的紫外吸收波長未有報(bào)道，為了確定最佳的紫外吸收波長，對植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液進(jìn)行了全波長掃描，結(jié)果如圖2所示。

圖2 植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液的全波長掃描圖

由圖2可知，植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液紫外吸收最大的波長為208 nm和232 nm，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，故高效液相色譜條件中紫外檢測器波長設(shè)置為205、233 nm。

2.3 高效液相色譜柱的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，C18高效液相色譜柱在脂肪酸制備中應(yīng)用廣泛，而C30高效液相色譜柱更適合分離同分異構(gòu)體。由于植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵產(chǎn)生的3種CLNA異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相似，差異甚小，故將C18高效液相色譜柱Hypersil(3GOLD-C18，100 mm×2.1 mm)和C30高效液相色譜柱Ultimate?(5XB-C30，4.6 mm×250 mm)進(jìn)行比較，通過質(zhì)譜圖中離子的質(zhì)荷比大小，對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。參考Kichino等[16]分離羥基脂肪酸的條件，設(shè)置流動(dòng)相為乙腈-H2O(體積比80∶20)，流速0.25 mL/min(C18柱)，1 mL/min(C30柱)，并進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。

注：A.C18色譜柱條件優(yōu)化前，流動(dòng)相為乙腈-H2O(體積比80∶20)；B.C18色譜柱條件優(yōu)化后，流動(dòng)相為乙腈-H2O(體積比50∶50)；C.C30色譜柱條件優(yōu)化前，流動(dòng)相為乙腈-H2O(體積比80∶20)；D.C30色譜柱條件優(yōu)化后，流動(dòng)相為乙腈-H2O(體積比50∶50)。

圖3高效液相色譜柱的篩選

由于LNA只在205 nm波長下有吸收，而CLNA在205 nm和233 nm波長下均有吸收，故比較分離條件時(shí)僅比較了205 nm波長下的結(jié)果。

由圖3可知，隨著流動(dòng)相中有機(jī)相的比例減少，液相色譜洗脫能力減弱，保留時(shí)間變長，但CLNA異構(gòu)體逐漸分離開來。當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-H2O(體積比50∶50)時(shí)，C18高效液相色譜柱分離到CLNA1、CLNA2兩種CLNA異構(gòu)體，并且基本達(dá)到基線分離；C30高效液相色譜柱比C18高效液相色譜柱的保留時(shí)間長，但可以分離到CLNA1、CLNA2、CLNA3 3種CLNA異構(gòu)體，故選擇C30高效液相色譜柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 流動(dòng)相的優(yōu)化

經(jīng)過前期分離條件的優(yōu)化和對比，C30高效液相色譜柱可以分離得到3種CLNA異構(gòu)體，但目前樣品中CLNA異構(gòu)體的分離色譜峰峰形欠佳，拖尾嚴(yán)重，分離度小，保留時(shí)間不穩(wěn)定，仍需進(jìn)一步優(yōu)化。高效液相色譜分離方法中經(jīng)常添加0.1%甲酸或醋酸銨來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸堿度，進(jìn)而提高峰形質(zhì)量。由于甲酸易揮發(fā)，不會與CLNA發(fā)生反應(yīng)，分離過程中對樣品的影響較小，故選擇甲酸調(diào)節(jié)酸堿度，以改善峰形。

由于本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相消耗量較大，考慮到乙腈成本高，并且毒性比相似極性的甲醇大，所以嘗試甲醇作為流動(dòng)相，流速1 mL/min，分離條件經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果如圖4所示。

注：A.流動(dòng)相為乙腈-H2O(體積比50∶50)；B.流動(dòng)相為乙腈-H2O-甲酸(體積比50∶50∶0.01)；C.流動(dòng)相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)。

圖4流動(dòng)相的優(yōu)化

由圖4可知，流動(dòng)相添加甲酸后，峰形得到了很好的改善，峰形變尖銳，異構(gòu)體之間的分離度更好。雖然保留時(shí)間變長，但是改善了保留時(shí)間不穩(wěn)定的問題；當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)時(shí)，雖然CLNA的分離度與乙腈-H2O-甲酸(體積比50∶50∶0.01)條件相似，但流動(dòng)相中有機(jī)相的比例升高，保留時(shí)間縮短，有利于后續(xù)除去流動(dòng)相及提高分離制備效率。由于樣品中CLNA3的含量低，且甲醇在205 nm波長下有部分吸收，導(dǎo)致C30高效液相色譜柱在205 nm波長條件下基線波動(dòng)劇烈，所以在205 nm條件下沒有檢測到CLNA3。

當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-H2O-甲酸(70∶30∶0.01)時(shí)，CLNA的保留時(shí)間長，為了縮短保留時(shí)間，提高制備效率，嘗試了梯度洗脫。結(jié)果表明，梯度洗脫時(shí)，基線漂移非常嚴(yán)重，且LNA與CLNA1的分離度不佳，改善梯度洗脫的條件也未能達(dá)到預(yù)想的目的，故梯度洗脫不適合C30高效液相色譜柱分離乳酸菌源CLNA異構(gòu)體。

2.5 CLNA最優(yōu)分離條件的重復(fù)性驗(yàn)證及CLNA異構(gòu)體的純度檢測

將分離CLNA的最優(yōu)條件即C30高效液相色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)，流速為1 mL/min 進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以精密度為指標(biāo)檢驗(yàn)方法的重復(fù)性，并將分離得到的各個(gè)CLNA異構(gòu)體進(jìn)行純度檢測，結(jié)果如表1和圖5所示。

表1 CLNA最優(yōu)分離條件的精密度

由表1可知，CLNA 3種異構(gòu)體在最優(yōu)分離條件下保留時(shí)間的RSD范圍為0.05%～0.38%，峰面積的RSD范圍為1.88%～4.65%，故該方法對3種CLNA異構(gòu)體的測定有良好的精密度；由圖5A、B可知，C30高效液相色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)，流速為1 mL/min條件，LNA和CLNA1、CLNA1和CLNA2以及CLNA2和CLNA3的分離度高，重復(fù)性好。所以該條件是HPLC-UV分離乳酸菌源游離態(tài)CLNA的最優(yōu)條件。為了提高分離制備的效率，在保證色譜柱一定的分離度下可以適當(dāng)增加樣品濃度以增加上樣量，同時(shí)可升高樣品和色譜柱的溫度至37℃，使樣品的溶解性更好，以達(dá)到高效分離制備的目的。

分離制備產(chǎn)物經(jīng)過甲酯化后進(jìn)行GC-MS純度檢測，結(jié)果得到CLNA1的純度為97.48%，其中摻雜少量CLNA2；CLNA2的純度為100%；CLNA3的純度為65.30%，摻雜部分CLA，可能是由于在液相色譜圖中CLNA3及CLA的含量太少，檢測信號強(qiáng)度低，導(dǎo)致沒有分離開來。總之，部分制備產(chǎn)物的純度達(dá)到了單一異構(gòu)體純度要求。

注：A.最優(yōu)分離條件在205 nm波長下的液相色譜圖；B.最優(yōu)分離條件在233 nm波長下的液相色譜圖；C.CLNA1的氣相色譜圖；D.CLNA2的氣相色譜圖；E.CLNA3的氣相色譜圖。

圖5CLNA最優(yōu)分離條件的重復(fù)性驗(yàn)證及3種CLNA異構(gòu)體的純度檢測

3 結(jié) 論

本文通過薄層色譜和液相色譜的方法，對分離條件進(jìn)行優(yōu)化，確立了分離制備乳酸菌發(fā)酵液中CLNA的最優(yōu)條件：色譜柱Ultimate?(5XB-C30，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸(體積比70∶30∶0.01)；流速為1 mL/min；檢測紫外波長為205 nm和233 nm。該條件可以分離到3種CLNA異構(gòu)體，并且分離度好，精密度高。制備得到的CLNA1純度為97.48%，CLNA2的純度為100%，CLNA3的純度為65.30%。本實(shí)驗(yàn)也證明了薄層色譜法中展開劑為氯仿-甲醇-乙酸不能應(yīng)用于分離乳酸菌發(fā)酵液中游離態(tài)CLNA異構(gòu)體；C30高效液相色譜柱更適合分離乳酸菌發(fā)酵液中結(jié)構(gòu)差異很小的游離態(tài)CLNA異構(gòu)體；為了提高分離制備的效率，在保證色譜柱一定的分離度下可以適當(dāng)增加樣品濃度以增加上樣量，同時(shí)升高樣品和色譜柱的溫度至37℃使樣品的溶解性更好，來達(dá)到高效分離制備的目的。雖然本文首次建立了分離制備乳酸菌源游離態(tài)CLNA的方法，但是液相色譜圖中CLNA3和CLA的檢測信號強(qiáng)度太低，導(dǎo)致兩者沒有分離開來，純度有待提高，后期可以進(jìn)行第二次制備來獲得更高純度的CLNA3，為單一異構(gòu)體的功能研究奠定基礎(chǔ)。