田加坤，陳星海，張 敏，李杏良，紀(jì)富溪，劉德新*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 急救醫(yī)學(xué)科,吉林 長(zhǎng)春130041；2.河南省醫(yī)院 急診科)

膿毒性休克是目前危重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高發(fā)病率和高病死率的疾病，在美國(guó)和歐洲，發(fā)病率每年以1.5%的速度遞增，原因與免疫系統(tǒng)功能缺陷病人數(shù)目的增加、耐藥菌的感染、高風(fēng)險(xiǎn)的手術(shù)干預(yù)等因素有關(guān)，并且病死率隨著年齡和衰竭器官數(shù)目的增加而增加[1-6]。液體復(fù)蘇是膿毒性休克救治中重要手段之一，《2012嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克管理指南》進(jìn)一步強(qiáng)化集束化治療策略，強(qiáng)調(diào)早期液體復(fù)蘇，規(guī)定了復(fù)蘇目標(biāo)值，指出對(duì)膿毒癥所致組織灌注不足的患者可采取液體沖擊療法，至少按30 ml/kg輸注晶體液，直至患者血流動(dòng)力學(xué)獲得改善[7]。但由于臨床常用的液體復(fù)蘇劑量個(gè)體差異較大，且部分患者合并心肺功能不全，多大劑量液體復(fù)蘇更安全有效，以及液體復(fù)蘇對(duì)膿毒性休克發(fā)病機(jī)制方面的影響仍不明確。本研究通過(guò)膿毒性休克大鼠模型進(jìn)行不同劑量液體沖擊復(fù)蘇，探討不同劑量液體復(fù)蘇對(duì)膿毒性休克大鼠的炎癥因子影響及對(duì)液體復(fù)蘇安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為尋找膿毒性休克時(shí)最佳液體復(fù)蘇劑量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

清潔級(jí) S-D 大鼠36只，年齡 6-8周左右，體重為 193.4±11.7 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。復(fù)方氯化鈉注射液(四平市巨能藥業(yè)有限公司)；大鼠TNF-α、IL-6、IL-10定量ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司；BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及液體復(fù)蘇方法

膿毒性休克大鼠模型制備:麻醉后大鼠取仰臥位，碘伏消毒中下腹部皮膚備皮后，提起腹部皮膚，用眼科剪于腹白線中點(diǎn)下方約 0.3 cm 處逐層剪開皮膚、肌層和腹膜約 1.5 cm的長(zhǎng)度，另只手用平鑷固定肌層，探開腹腔后在直視下，尋找盲腸末端后逐步游離并置于腹腔外；用 4 號(hào)縫合線結(jié)扎距盲腸末端約 1.5 cm 處，結(jié)扎后用直徑1.5 mm大針穿刺針垂直盲腸穿刺 2 孔；針尾帶入20 mm×2.5 mm腹腔引流條2條，貫穿腸管，還納盲腸，4 號(hào)線逐層縫合關(guān)腹。頸動(dòng)脈置管連接BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠血壓，大鼠血壓下降為基礎(chǔ)值的30%定義為膿毒癥休克模型制備完成。股靜脈置管為補(bǔ)液做準(zhǔn)備。

液體復(fù)蘇：將出現(xiàn)血壓下降達(dá)到休克的大鼠36只，隨機(jī)分為30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復(fù)蘇組，每組12只，分別按30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg劑量給予液體沖擊補(bǔ)液，待血壓穩(wěn)定后，減慢輸液速度，若再次出現(xiàn)血壓下降可重復(fù)進(jìn)行不同劑量液體沖擊直至血壓穩(wěn)定，密切觀察大鼠一般情況及行為學(xué)變化等特征情況。

1.3 觀察指標(biāo)

三組大鼠均在液體復(fù)蘇開始、液體復(fù)蘇后3小時(shí)及液體復(fù)蘇后6小時(shí)抽血，用ELISA方法測(cè)定血清TNF-α，IL-6和 IL-10水平；液體復(fù)蘇6小時(shí)后處死動(dòng)物觀察三組大鼠肺、肝、腎、心臟組織結(jié)構(gòu)的病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 液體復(fù)蘇后膿毒性休克大鼠一般情況及行為變化

對(duì)膿毒性休克大鼠進(jìn)行不同劑量液體復(fù)蘇，平均2.5-4 h時(shí)出現(xiàn)大量尿液。液體復(fù)蘇開始時(shí)大鼠仍較為活躍，后期逐漸出現(xiàn)豎毛，毛色晦暗，身體捲縮，略發(fā)抖，觸之易受驚，活動(dòng)飲水進(jìn)食少，偶出現(xiàn)腹瀉，反應(yīng)遲緩，眼角分泌物增多。

2.2 不同劑量液體復(fù)蘇對(duì)大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平的影響

本研究對(duì)膿毒性休克大鼠分別給予30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復(fù)蘇，記錄3組大鼠液體復(fù)蘇開始、復(fù)蘇3 h、復(fù)蘇6 h血清中促炎因子TNF-α、IL-6水平及抗炎因子IL-10水平。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)液體復(fù)蘇3 h、6 h后，膿毒性休克大鼠的促炎因子TNF-α、IL-6水平較液體復(fù)蘇開始時(shí)下降，抗炎因子IL-10水平升高，P<0.05。但比較30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復(fù)蘇3組之間大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-10水平，差異無(wú)顯著性，P>0.05。提示液體復(fù)蘇能降低膿毒性休克時(shí)機(jī)體促炎因子水平，同時(shí)升高抗炎因子水平，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)失衡。30 ml/kg、45 ml/kg液體復(fù)蘇即能抑制全身炎癥反應(yīng)，繼續(xù)加大液體復(fù)蘇劑量并未進(jìn)一步改善全身炎癥反應(yīng)狀態(tài),結(jié)果見表1-3。

表1 不同劑量液體復(fù)蘇后大鼠血清TNF-α水平比較

注：※與液體復(fù)蘇開始時(shí)比較，P<0.05；△各組間比較，P>0.05。

表2 不同劑量液體復(fù)蘇后大鼠血清IL-6水平比較

注：※與液體復(fù)蘇開始時(shí)比較，P<0.05；△各組間比較，P>0.05。

表3 不同劑量液體復(fù)蘇后大鼠血清IL-10水平比較

注：※與液體復(fù)蘇開始時(shí)比較，P<0.05；△各組間比較，P>0.05。

2.3 不同劑量液體復(fù)蘇后膿毒性休克大鼠的病理變化

液體復(fù)蘇6 h后處死大鼠，大體解剖見結(jié)扎處盲腸腫脹嚴(yán)重，周圍腸管有化膿現(xiàn)象，且與周圍胰、小腸、胃等組織粘連，有血性腹水及惡臭。其余臟器組織略顯蒼白，臟器表面有散在出血點(diǎn)，肝臟淤血增大。不同劑量液體復(fù)蘇組大鼠的肺、肝、腎、心臟大體病理改變無(wú)顯著差別。

光鏡觀察三組大鼠液體復(fù)蘇6 h后，肺組織出現(xiàn)血小板聚集和纖維蛋白沉積在肺毛細(xì)血管，局部可見血管淤血，白細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡蛋白沉積，呈現(xiàn)出富含蛋白質(zhì)的肺泡水腫，纖維蛋白沉積為透明膜覆蓋肺泡上皮，間質(zhì)纖維化、肺充血和肺萎陷混合存在。3組間比較無(wú)明顯差異，見圖1。

圖1 不同劑量液體復(fù)蘇6 h后大鼠肺組織HE染色(400×)

液體復(fù)蘇6 h后，3組大鼠肝臟組織可見小葉中心肝竇擴(kuò)張充血，偶見周圍的單個(gè)肝細(xì)胞壞死，小葉中心肝細(xì)胞壞死或中間地帶枯否氏細(xì)胞腫脹，壞死，血栓形成和微肝細(xì)胞空泡化，值得注意的是， 60 ml/kg液體復(fù)蘇組大鼠肝周可見細(xì)胞腫脹，較30 ml/kg、45 ml/kg液體復(fù)蘇組明顯，見圖2。

圖2 不同劑量液體復(fù)蘇6 h后大鼠肝臟組織HE染色(400×)

液體復(fù)蘇6 h后，3組大鼠腎臟可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球腫脹，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管型。偶見腎小球毛細(xì)血管內(nèi)存在微血栓形成，腎小管壞死，管腔擴(kuò)張、腎小管空泡膨脹的嗜堿性粒細(xì)胞的變化。3組之間病理改變未見明顯差異。見圖3。

圖3 不同劑量液體復(fù)蘇6 h后大鼠腎臟組織HE染色(400×)

液體復(fù)蘇6 h后，膿毒性休克大鼠心肌組織可見非特異性的組織學(xué)變化，偶見間質(zhì)水腫，心肌微血管內(nèi)纖維蛋白沉積、心肌肌纖維排列紊亂。少見心肌壞死、血栓，心內(nèi)膜和心外膜出血的局限性出血。比較3組大鼠病理改變未見明顯差異。見圖4。

圖4 不同劑量液體復(fù)蘇6 h后大鼠心臟組織HE染色(400×)

3 討論

膿毒性休克引起多器官功能障礙的重要發(fā)病機(jī)制是感染、毒素、以及血流動(dòng)力學(xué)紊亂誘導(dǎo)大量炎癥因子的釋放，凝血功能障礙、進(jìn)而造成重要臟器損害，其中促炎及抗炎反應(yīng)失衡是膿毒性休克病理生理過(guò)程中的關(guān)鍵因素[8,9]。IL-6，TNF-α是重要的促炎因子，可以通過(guò)促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集、活化及炎癥因子的分泌等方式在膿毒性休克的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，炎癥因子表達(dá)的水平與膿毒性休克的嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)[10-14]。

充分的液體復(fù)蘇是治療膿毒性休克的至關(guān)重要的措施之一，目前指南推薦的是基于Rivers等于 2001 年提出的“早期目標(biāo)導(dǎo)向治療” (early goal-directed therapy，EGDT)，強(qiáng)調(diào)在動(dòng)態(tài)定量指標(biāo)的指導(dǎo)下進(jìn)行滴定式治療。他們研究發(fā)現(xiàn)膿毒性休克最初6 h經(jīng)過(guò)積極早期目標(biāo)導(dǎo)向治療后，患者的28天病死率下降16%[15]。近期也有對(duì)EGDT不改變預(yù)后提出質(zhì)疑的聲音，特別是臨床實(shí)踐中多大劑量液體能更快速、更安全有效地用于膿毒性休克復(fù)蘇并不明確,甚至存在爭(zhēng)議[16-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行液體沖擊治療后大鼠促炎因子表達(dá)水平顯著降低，抗炎因子水平則顯著升高，提示30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復(fù)蘇都可以抑制膿毒性休克炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，進(jìn)而可能改善預(yù)后。但比較不同劑量液體復(fù)蘇組炎癥因子水平，結(jié)果顯示組間無(wú)顯著性差異，表明30 ml/kg-60 ml/kg液體復(fù)蘇對(duì)穩(wěn)定膿毒性休克是有益的，但繼續(xù)增加補(bǔ)液量并未對(duì)炎癥因子產(chǎn)生明顯的影響，單純采取液體復(fù)蘇的手段對(duì)膿毒性休克時(shí)促炎抗炎反應(yīng)失衡的調(diào)控是有限的，仍需要去除根本病因并采取集束化治療。

本研究中使用不同劑量液體蘇6 h后，觀察各組大鼠肺、肝、腎、心臟的病理改變，并未出現(xiàn)所估計(jì)嚴(yán)重水腫的出現(xiàn)，組間比較病理改變無(wú)顯著性差異。但值得注意的是，在60 ml/kg液體復(fù)蘇組發(fā)現(xiàn)肝周細(xì)胞腫脹，較30 ml/kg、45 ml/kg液體復(fù)蘇組明顯。在臨床實(shí)踐中，由于積極的液體復(fù)蘇常導(dǎo)致液體過(guò)負(fù)荷，加上毛細(xì)血管滲漏等因素，容易加重心、肺、肝、腎等重要臟器損傷,使膿毒性休克的病死率升高。Vicent JL等研究發(fā)現(xiàn)，24個(gè)國(guó)家198個(gè)ICU中1177例膿毒癥和1970例非膿毒癥患者相比，每日液體正平衡分別為1.8 L和0.5 L，每日液體正平衡量增加1 L，死亡的危險(xiǎn)性便增加10%，而且經(jīng)過(guò)多因素相關(guān)性分析證實(shí)液體超負(fù)荷是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]。近年來(lái)隨著無(wú)創(chuàng)和微創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)更多的應(yīng)用于膿毒癥患者的評(píng)估證實(shí)，避免液體過(guò)負(fù)荷有利于改善膿毒癥的預(yù)后，本研究證實(shí)，對(duì)于大鼠膿毒性休克模型，30-45 ml/kg的早期液體沖擊復(fù)蘇相對(duì)安全，繼續(xù)加大液體劑量可能有液體過(guò)負(fù)荷及加重毛細(xì)血管滲漏以及組織器官腫脹的風(fēng)險(xiǎn)。