宋鐵英

由于丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的丙型肝炎已成為世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。而輸血是HCV的重要傳播途徑之一，因此為了控制HCV的感染和經(jīng)血傳播，臨床要求對無償獻血者的血液樣本進行丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)的篩查[2]。目前臨床血液抗-HCV篩查采用的第三代抗HCV抗體試劑以間接酶聯(lián)免疫法診斷試劑為主[3]。對于一種或兩種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)診斷陽性的血液即判為不合格予以棄用，獻血者也被淘汰棄用。但是由于間接ELISA法檢測由于會受到血清中非特異性IgG以類風(fēng)濕因子等因素的干擾，存在一定的假陽性概率，造成誤差獻血樣本的浪費和獻血者的異常淘汰[4]。而且間接ELISA法檢測的窗口期較長。而雙抗原夾心ELISA法不受非特異性IgG的干擾，其特異性和靈敏性較間接法有所提高，近年來在梅毒抗體、抗HIV的檢測中均得到了成功應(yīng)用[5-6]。本次研究收集2017年4月至2018年1月我院經(jīng)間接法ELISA檢測的抗-HCV單試劑或雙試劑反應(yīng)性的獻血者標本72份以及1 850份無償獻血者樣本作為研究對象，分別采用雙抗原夾心ELISA法和間接ELISA法三種試劑進行檢測，并采用重組免疫印跡實驗(RIBA)進行進一步確認，以分析探討應(yīng)用ELISA法檢測抗-HCV的應(yīng)用效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2017年4月至2018年1月我院經(jīng)間接法ELISA檢測的抗-HCV單試劑或雙試劑反應(yīng)性的獻血者標本72份以及1 850份無償獻血者樣本作為研究對象，所有血液樣本均采用EDTA-K2進行抗凝，并保存在-20℃條件下待檢。

1.2 主要儀器與試劑 瑞士TECEN公司的Genesis RSP150自動加樣儀、德國貝靈公司的BEPIII酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)，雷勃公司的ASCENT全自動酶標儀以及美國BIOTEK公司的ELX50洗板機，上海浩源公司的ChiTas BSS1200血液核酸檢測系統(tǒng)，美國ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)。間接ELISA抗-HCV試劑盒由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司(批號：CS20160718)和美國雅培公司(批號V707310)提供。雙抗原夾心ELISA抗-HCV試劑盒由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司(批號：CS20160801)提供，確認試劑ChironRIBA HCV 3.0 SIA(RIBA)由美國Chiron公司(批號：166289)提供。儀器設(shè)備定期維護，所有試劑均在有效期內(nèi)，嚴格按照試劑盒內(nèi)說明書操作進行檢測。

1.3 方法 將收集的獻血者標本以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速進行離心10 min，離心完成后分離血清。然后分別用間接ELISA法試劑盒和雙抗原夾心ELISA試劑盒嚴格按照說明書操作進行三種試劑的單孔檢測，若單孔檢測呈陰性反應(yīng)則視為陰性，若呈初次反應(yīng)性則進行雙孔復(fù)試，出現(xiàn)1孔或雙孔呈反應(yīng)性則判讀為陽性，而雙孔均呈無反應(yīng)性則判讀為陰性，記錄三種試劑的檢測的結(jié)果。對于有一種以上試劑呈反應(yīng)性(包括單試劑反應(yīng)性、雙試劑反應(yīng)性及三種試劑均呈反應(yīng)性)的標本采用RIBA進行進一步確認。本次研究中不確定視為陰性，以RIBA檢測陰性或三種試劑均為陰性作為真陰性的標準。分析兩種檢測方法三種試劑的陽性檢出率、特異性及符合性。

2 結(jié)果

2.1 三種試劑檢測一般情況 在總共1 922份檢測樣本中，三種試劑均為反應(yīng)性的為30份，雙試劑反應(yīng)性的6份(其中雙間接法試劑陽性5份，雅培間接試劑和萬泰雙抗原夾心試劑陽性1份)，單試劑反應(yīng)性10份(其中雅培間接試劑陽性6例，萬泰間接試劑4例)，三種試劑均為陰性反應(yīng)性1 871份。

2.2 反應(yīng)性樣本檢測結(jié)果與RIBA比較 1 922份檢測樣本中一種以上反應(yīng)性樣本合計51例，經(jīng)RIBA驗證，陽性29例，陰性22例。三種試劑的檢測結(jié)果與RIBA驗證結(jié)果的符合性(表1)。萬泰雙抗原夾心試劑診斷的假陽性率明顯低于雅培間接試劑和萬泰間接試劑，診斷與RIBA的符合率則高于兩種間接法試劑，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 反應(yīng)性樣本檢測結(jié)果與RIBA符合性(n) 單位：份

表2 三種檢測試劑的效能分析 單位：%

2.3 三種檢測試劑的特異性分析 1 871份陰性檢測樣本中，萬泰間接試劑、雅培間接試劑和萬泰雙抗原夾心試劑診斷的特異度分別為96.69%、94.28%、99.79%，萬泰雙抗原夾心試劑診斷的特異度明顯高于兩種間接法試劑，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

表3 三種檢測試劑的特異性分析

3 討論

HCV感染初期癥狀較輕，但可能造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，有研究發(fā)現(xiàn)近年由于HCV感染引發(fā)肝硬化、肝癌的病死率呈逐漸上升的趨勢[7]。血液傳播是HCV的主要途徑，因此血液篩查HCV抗體成為控制HCV傳播的重要手段。ELISA法是目前檢測丙型肝炎病毒抗體的主要方法，其中又以間接法ELISA應(yīng)用最廣[8]。但是間接ELISA法存在一定的缺陷，它檢測試劑均以二抗作為酶結(jié)合物，少量IgG非特異吸附和類風(fēng)濕因子的吸附均可能造成假陽性結(jié)果，因此各種試劑均不可避免的存在一定比例的生物學(xué)假陽性[9]。而且間接ELISA法在操作時，需要對血液樣本進行稀釋以降低IgG濃度，但這一操作可能會造成靈敏度降低，甚至樣本污染，干擾檢測結(jié)果[10]。雙抗原夾心ELISA法在間接法檢測IgG的基礎(chǔ)上對包括IgG、IgM等在內(nèi)的總抗體進行了檢測，提高了抗-HCV的檢出率，另外它形成包被抗原-抗體-生物素化抗原復(fù)合物能通過兩次特異性反應(yīng)系統(tǒng)，減少非特異性的IgG的干擾，從而提高檢測的敏感度和特異度[11]。RIBA是目前公認的抗-HCV最為準確有效的檢測方法[12]。本次研究將兩種間接法ELISA試劑和一種雙抗原夾心ELISA試劑與RIBA的檢查結(jié)果進行了對比，發(fā)現(xiàn)51例一種以上試劑的反應(yīng)性樣本中，經(jīng)RIBA驗證，陽性29例，陰性22例。萬泰雙抗原夾心試劑診斷的假陽性率為9.09%，明顯低于雅培間接試劑和萬泰間接試劑，與RIBA的符合率為96.08%，明顯高于兩種間接法試劑的。而1 871份陰性檢測樣本中，萬泰間接試劑、雅培間接試劑和萬泰雙抗原夾心試劑診斷的特異度分別為96.69%、94.28%、99.79%，萬泰雙抗原夾心試劑診斷的特異度明顯高于兩種間接法試劑。這與目前國內(nèi)其他學(xué)者的[13-14]研究結(jié)果相近，表明與間接法的單特異性系統(tǒng)相比，雙抗原夾心法的雙特異性系統(tǒng)診斷的生物學(xué)假陽性明顯降低，其特異性和準確率均有了較大提升，能減少假陽性血液浪費和獻血者的流失。另外本次研究發(fā)現(xiàn)萬泰間接診斷試劑診斷的符合率和陰性樣本的特異度均高于雅培間接診斷試劑，分析可能與萬泰為國產(chǎn)試劑，其診斷臨界值遠低于進口試劑，美國CDC的這種規(guī)定不適用國產(chǎn)試劑有關(guān)[15]。不過本次研究更側(cè)重于對夾心法和間接法的特異度比較，因此對于靈敏度的問題有待進一步研究論證。

綜上所述，應(yīng)用雙抗原夾心法診斷試劑者檢測血液樣本抗-HCV具有較高的特異性和準確性，能降低生物學(xué)假陽性，值得在臨床血液樣本的抗-HCV篩查中進行廣泛推廣應(yīng)用。