胡偉 靳宏虎 沈豐 武倫

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是惡性程度高、進展快，嚴重危害人類健康的疾病，其發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中分別位居第5位和第2位。大部分患者臨床確診為肝癌時已經(jīng)處于晚期，5年生存率小于5%。HCC發(fā)生發(fā)展是由多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，受著多種基因共同調(diào)控，最新研究發(fā)現(xiàn)肽酰脯氨酰異構(gòu)酶(PPI)家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能參與了乳腺癌、肺癌等的發(fā)病過程，在腫瘤的生長轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]，肽酰脯氨酰異構(gòu)酶(親環(huán)素)樣1[peptidyl-prolyl isomerase (cyclophilin)-like 1，PPIL1]是肽酰脯氨酰異構(gòu)酶親環(huán)蛋白家族成員之一，是其家族中重要的效應(yīng)分子，具有一系列重要的生物學作用，如細胞周期調(diào)節(jié)、分化等，尤其是該蛋白能加速蛋白質(zhì)的折疊和催化肽脯氨酸亞胺肽鍵的異構(gòu)化，可特異性地結(jié)合磷酸化后的Ser /Thr-Pro結(jié)構(gòu)域，導致目的蛋白構(gòu)象發(fā)生變化[3-4]。鑒于PPIL1參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及細胞周期調(diào)控等諸多方面，本研究采用免疫組化的方法檢測PPIL1蛋白在肝癌組織的表達、分析與臨床相關(guān)指標的關(guān)系，以期進一步探討PPIL1在HCC發(fā)病中的作用機制，為探索可能的防治策略提供思路。

資料和方法

一、 標本及病例

選取在本院行外科手術(shù)切除或經(jīng)皮肝穿刺活檢肝癌標本80例，術(shù)前患者未行任何治療，均經(jīng)病理檢查證實。其中男50例，女30例，年齡30～60歲；有轉(zhuǎn)移(侵犯門靜脈及其分支或肝外遠處轉(zhuǎn)移)的49例；TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ ～Ⅳ期50例，另取5例癌旁正常肝組織為對照。標本經(jīng)常規(guī)脫水、4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚3～ 5μm)。

二、試劑

PPIL1多克隆抗體購于GeneTex公司，免疫組化染色試劑盒等均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

三、方法

采用免疫組織化學SP法染色，PPIL1抗體(1∶100稀釋)，以PBS代替一抗作陰性對照。主要步驟：脫蠟，水化，滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，組織抗原修復后血清封，加一抗4℃過夜；次日依次加入生物素標記加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，封片，顯微鏡下觀察。

四、實時定量PCR法測組織PPIL1 mRNA表達水平

組織總RNA和基因組DNA的提取按照TRIzol試劑的說明操作。濃度用 (Thermo公司，美國)檢測試劑盒。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，美國)說明將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成c DNA。PCR反應(yīng)體系：按照試劑盒說明，反應(yīng)體系20 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板2.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min，35個循環(huán)。PPIL1:上游引5′-TGGCTTTGCAAGTCATGAAG-3′，下游引物5′-CATGCACAAGAAGCAGCATT-3′，以β-actin作為內(nèi)參照，以PPIL1 mRNA的CT值與β-actin mRNA的CT值的差值的2-ΔΔCT作為其相對的表達量。

五、結(jié)果判斷

依據(jù)國內(nèi)外標準，綜合PPIL1蛋白染色強度和陽性細胞所占比例數(shù)，結(jié)合兩方面計算積分[8]。陽性細胞所占百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細胞數(shù)≤ 10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%；染色強度打分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；根據(jù)兩方面積分判斷陽性程度：1～3分為弱陽性(+)；3～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)，中度及以上判斷為PPIL1蛋白高表達，否則為低表達。

六、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、PPIL1蛋白表達主要位于癌細胞的胞漿區(qū)，呈淡黃色或棕黃色(圖1A)；正常肝組織中呈低表達，肝癌組織中的表達與正常肝組織比較具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。PPIL1蛋白表達在年齡、性別等方面無差異，而在分期、轉(zhuǎn)移情況方面差異顯著(P<0.05)，80例肝癌患者的臨床病理特征及其與PPIL1表達的關(guān)系見表1。

注：A陽性；B陰性對照

臨床病理參數(shù)nPPIL1蛋白陽性P性別 男48390.816 女3224分期 Ⅰ、Ⅱ期2060.017 Ⅲ、Ⅳ期6057年齡 ≥48歲2080.077 <48歲5650轉(zhuǎn)移 有56490.029 無248肝功能分級 Child-Pugh A51400.622 Child-Pugh B3926

二、 Q-PCR檢測兩組PPIL1 mRNA表達與對照組比較，PPIL1 mRNA在癌組織中表達升高(P<0.01)，其與蛋白表達水平和趨勢基本一致(見圖2)。

注：與對照組比較，P<0.05

討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移是一個相當復雜的過程。PPIL1蛋白參與了多種信號通路的調(diào)節(jié)，而且在許多腫瘤中過表達，可加強和活化多種致癌信號，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)位點位于脯氨酸前端，磷酸化是一個重要的細胞內(nèi)信號傳導機制，可以控制多種細胞調(diào)節(jié)過程，如細胞周期調(diào)控、細胞分化和增殖等[5]。PPIL1是親環(huán)素類的肽酰脯氨酰異構(gòu)酶，是一種高度保守的酶，廣泛存在于組織細胞中，能特異性地異構(gòu)某些磷酸化的Ser /Thr-Pro 鏈，促進底物蛋白質(zhì)的折疊和構(gòu)象改變，催化肽脯氨酸亞胺肽鍵的異構(gòu)化[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，蛋白折疊和構(gòu)象改變在許多細胞的功能調(diào)節(jié)上是一種新的信號調(diào)控機制,從一個新的領(lǐng)域去研究疾病的發(fā)病機制和治療[7-8]。因此把PPIL1相關(guān)信號轉(zhuǎn)導和癌癥發(fā)病機制聯(lián)系起來研究，具有重要意義。

在本研究發(fā)現(xiàn)，PPIL1在原發(fā)性癌組織中過表達，并且PPIL1過表達與臨床病理分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，均有統(tǒng)計學意義。高表達PPIL1的腫瘤組織往往侵襲力較強，發(fā)展較快，較早出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，導致發(fā)現(xiàn)時就處于較晚分期。本研究結(jié)果也顯示了在肝癌組織中，尤其是分化較差的癌組織中PPIL1高表達，提示PPIL1蛋白和mRNA高表達與肝癌快速生長、分期晚和生存期短相關(guān)，表明其可作為一個臨床肝癌預后的潛在指標。