梁智超， 姬鳳彩， 孫建新， 蔣遠東， 劉 昕， 阿吉古麗·吐爾洪， 魏后樂

(新疆醫(yī)科大學1公共衛(wèi)生學院， 2動物實驗中心， 3護理學院， 烏魯木齊 830011)

目前，針對肝癌的實驗室研究有很多，研究人員常利用大鼠肝癌模型對肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、治療等進行研究[1-2]。實驗室研究具有不受時間限制、個體差異小、研究對象數(shù)量容易控制等優(yōu)點，受到廣大研究者的青睞。實驗室研究中常利用肝癌動物模型進行研究[1]，肝癌動物模型中，又以大鼠肝癌模型易操作、成本低廉應用最為廣泛[2]。

肝癌模型的制備方法比較多，包括自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性、基因工程肝癌模型、注射式肝癌模型。自發(fā)性模型雖然與人類的發(fā)病機理、發(fā)病過程很相似，但是腫瘤發(fā)生率比較低且不穩(wěn)定。誘發(fā)性肝癌模型起病隱匿、病程較長，腫瘤多為彌漫結(jié)節(jié)型，合并或不合并肝硬化。基因工程肝癌模型為肝癌的基礎(chǔ)理論和臨床研究開辟更為理想的途徑，但技術(shù)要求極高，價格昂貴[3]。移植性肝癌模型又分為腫瘤組織包埋法和直接注射法，現(xiàn)有的實驗方法均是將大鼠開腹后，進行相應的操作，手術(shù)后的護理操作比較繁瑣，但造模周期短，腫瘤發(fā)生部位精確，有利于對腫瘤組織的觀察[4-5]。

實驗研究中常用到的有誘發(fā)性肝癌模型和移植性肝癌模型[6]。誘發(fā)性肝癌模型的肝癌出現(xiàn)的時間、部位、病灶數(shù)等的個體差異比較大，多用于肝癌病因?qū)W、發(fā)生學、發(fā)病機制、遺傳學方面的研究[7-8]。移植法肝癌模型是通過開腹手術(shù)將瘤塊組織包埋在肝包膜下[9-10]，腫瘤位于肝臟接種部位，呈圓形或橢圓形，膨脹性和浸潤性生長，腹水發(fā)生率高。此種模型的優(yōu)點是腫瘤生長在肝臟，與臨床肝癌病例基本相似，實驗周期短，模型易于建立，是研究肝癌局部治療的較好模型[10-11]。兩種肝癌模型制作方法均采用Wistar大鼠[12]，從造模操作方法的難易程度、腫瘤生長周期、大小、造模過程中產(chǎn)生的并發(fā)癥、造模的成功率、動物生長狀況等進行對比研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級Wistar大鼠，雄性， 70～100 g，30只。購自于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，生產(chǎn)許可證：SCXK(新)2016-0003 。

1.2材料Walker-256細胞株，購自于上海通派生物細胞庫，貨號walker 256細胞株。

1.3方法

1.3.1 腫瘤組織研磨液的制備 Walker-256細胞接種 于Wistar大鼠腋下，待腫瘤組織長出大約1 cm時，將腫瘤組織取出，剔除纖維包膜及壞死組織，超凈工作臺中在無菌平皿中剪碎，將腫瘤組織放入組織研磨器中，加入少量4℃生理鹽水輕輕研磨成勻漿，80目的細胞篩過濾成瘤細胞懸液，用生理鹽水調(diào)細胞濃度至107個/mL,臺盼藍染色，光鏡下瘤細胞計數(shù)，活瘤細胞>90%即可將試管放入碎冰中備用。

1.3.2 腫瘤細胞腹水懸液的制備 Walker-256細胞，接種于Wistar大鼠腹腔，傳代2代后收集腹水，離心，棄去上清液，留試管下層白色腫瘤細胞液體，將試管放入碎冰中備用。

1.3.3 大鼠分組及模型建立 30只雄性Wistar大鼠隨機分為3組，腫瘤組織研磨組、腫瘤細胞腹水懸液組、空白對照組,每組10只，腫瘤組織研磨組(模型1)采用腫瘤組織研磨得到細胞懸液注射肝臟造模；腫瘤細胞腹水懸液組(模型2)采用腫瘤細胞腹腔接種傳2代后得到的腹水注射肝臟造模；空白對照組采用0.9%生理鹽水注射肝臟造模。造模前將大鼠用3%的戊巴比妥鈉按照0.1 mL/100 g的劑量，腹腔注射進行麻醉。待大鼠進入深度麻醉狀態(tài)后，將大鼠仰臥于試驗臺接種造模物質(zhì)。注射部位在大鼠劍突下約0.5 cm，稍偏右側(cè)的位置，注射時先將此部位的皮膚提起，將針頭刺入皮下，然后再將針頭垂直進針刺入肝臟，進針深度約0.5 cm，接種完成后拔出針頭，按壓進針部位3～5 min。各組大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)，每日觀察大鼠的飲食、大小便、腹圍及精神狀態(tài),分組及造模情況見表1。

表1 分組及造模情況

1.3.4 解剖 各組注射造模物質(zhì)后，各組大鼠每日均正常飲食，觀察并記錄動物生長情況，于實驗第21天禁食不禁水，12 h后眼眶靜脈叢取血，分離血清，觀察血液指標。頸椎脫白處死大鼠并解剖。取出肝左葉，放入10%的福爾馬林中固定，HE染色法制作病理切片，觀察腫瘤生長情況。

2 結(jié)果

2.1剖檢觀察結(jié)果腫瘤組織研磨組和腫瘤細胞腹水懸液組的大鼠在接種造模物質(zhì)第5天后較空白對照組出現(xiàn)不同程度的豎毛、精神萎靡、活動減少、采食量下降、消瘦等狀況，腫瘤組織研磨組中有2只大鼠出現(xiàn)腹水。各組大鼠于造模物質(zhì)接種10 d后頸椎脫臼處死，解剖取出肝臟進行觀察?？瞻讓φ战M的肝臟為見腫瘤瘤體，腫瘤組織研磨組和腫瘤細胞腹水懸液組可見略突出于肝臟表面的乳白色菜花樣占位性瘤體，腫瘤組織研磨組的瘤體平均直徑為0.2～0.5 cm，腫瘤細胞腹水懸液組的瘤體平均直徑為1～2 cm。將瘤體剪開可見瘤體為實性、奶酪狀乳白色組織,各組造模結(jié)果見表2。

表2 3組造模結(jié)果

注：模型成功為不出現(xiàn)腹水且觀察到占位性瘤體，顯微鏡可觀察到腫瘤細胞。

2.2病理切片結(jié)果光學顯微鏡下觀察，腫瘤組織研磨組的肝小葉基本可見，肝細胞輕微水腫，肝血竇擴張，腫瘤細胞呈團塊狀分布，中央靜脈中可見有腫瘤細胞。腫瘤細胞腹水懸液組的腫瘤細胞呈巢狀分布，巢中有不同程度的出血壞死狀況，肝小葉的結(jié)構(gòu)基本破壞，肝細胞水腫，肝血竇擴張，中央靜脈中可見有腫瘤細胞存在。在400倍的高倍鏡下觀察，兩組模型的腫瘤細胞為橢圓形，均具有胞核大、強嗜堿性濃染、異型性明顯、有核分裂象、細胞大小不一、胞質(zhì)量少的特點。兩組模型均可見炎性細胞浸潤,見圖1～4。

圖1 腫瘤組織研磨組肝組織(×400)

圖2 腫瘤細胞腹水懸液組肝組織(×400)

圖3 腫瘤組織研磨組肝腫瘤細胞(×1 000)

圖4 腫瘤細胞腹水懸液組肝腫瘤細胞(×1 000)

3 討論

3.1大鼠品系和質(zhì)量的選取通過兩次預實驗發(fā)現(xiàn)，在進行Walker-256細胞腹腔傳代時必須選取Wistar大鼠才能造模成功。第一次實驗時使用SD大鼠接種腹腔，并未得到腫瘤腹水。在進行腫瘤細胞肝臟接種時也必須使用Wistar造模才能成功。本實驗大鼠的質(zhì)量需要控制在70～100 g的范圍內(nèi)，若Walker-256細胞接種在超過100 g的Wistar大鼠肝臟內(nèi)，造模成功率很低。

3.2瘤體懸液制備注意事項(1)在采集大鼠腋下瘤體時需要把握時機。 (2)大鼠腋下接種后第10天即可采集瘤體，此時瘤體大約1 cm大小，手感稍有彈性，剖檢可見瘤體為實性奶酪樣組織，此時采集瘤體做細胞懸液最合適。(3)當接種時間超過10 d后，瘤體有中空的感覺，剖檢后發(fā)現(xiàn)瘤體中間有血性液體，瘤體邊界呈現(xiàn)灰白色，組織易碎，采用瘤體制作的細胞懸液在鏡下觀察活細胞計數(shù)無法達到107個/mL。

3.3肝臟造模本課題組通過反復實驗證實，在進行癌細胞肝臟接種時，大鼠必須處于深度麻醉狀態(tài)，否則在注射進針時大鼠扭動身體將影響接種效果。接種完畢后拔針的同時壓住進針部位3 min以上，否則會造成造模物質(zhì)逆流進入腹腔產(chǎn)生惡性腹水。產(chǎn)生惡性腹水后10 d左右大鼠將會出現(xiàn)死亡的情況。本次實驗中腫瘤組織研磨組中有2只大鼠造模未成功，剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，肝臟上未出現(xiàn)瘤體，腹腔內(nèi)有大量紅色惡性腹水，可能是接種時針頭未進入肝臟，造模物質(zhì)直接進入腹腔所致。

3.4瘤體生長速度本研究通過對比分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織研磨組的肝臟瘤體小于腫瘤細胞腹水懸液組的瘤體。說明腫瘤細胞腹水懸液制作的肝癌模型的瘤體生長速度大于腫瘤組織研磨組，腫瘤細胞腹水懸液制作的模型更適合用于與腫瘤生長和抑制生長相關(guān)的課題研究，而腫瘤組織研磨得到的細胞液則更合適用于實驗周期長的研究。由于本次實驗旨在探索肝癌模型制作方法，因此，在接種瘤細胞第10天時結(jié)束實驗，未繼續(xù)觀察大鼠在第10天以后的狀態(tài)，以及大鼠因肝癌造成的死亡時間，這些均有待今后進一步研究。

3.5病理切片通過病理切片的觀察，本研究發(fā)現(xiàn)兩組模型的腫瘤細胞在形態(tài)和排列上沒有差別。從肝小葉的基本結(jié)構(gòu)觀察，腫瘤組織研磨組的肝小葉比較完整，腫瘤細胞腹水懸液組的肝小葉基本破壞，說明腫瘤細胞腹水懸液組的肝臟損傷程度更為嚴重。對中央靜脈中的細胞進一步觀察后發(fā)現(xiàn)，兩組模型的中央靜脈里均存在有腫瘤細胞，表明腫瘤細胞已經(jīng)進入血液，并向全身轉(zhuǎn)移，與腫瘤組織研磨組相比較，腫瘤細胞腹水懸液組的中央靜脈中的腫瘤細胞更多，提示腫瘤細胞腹水懸液組的全身轉(zhuǎn)移速度可能更快。