李春梅，王丹，侯典朋，魏麗娜

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院哈爾濱150028；2.黑龍江東方學院食品工程，哈爾濱150066）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，食品安全事件越來越受到人們的重視。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中，并且是人類身體上存在的微生物種類之一，大約25%～50%的金黃色葡萄球菌存在與人類的鼻腔當中[1-2]，是世界公認的食源性致病菌之一[3-4]。其產(chǎn)生的腸毒素會導致急性胃腸炎，嚴重的會引起重大的系統(tǒng)性疾病導致死亡[5-6]。在我國的細菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性中毒事件的四分之一。建立快速而準確的檢測手段是控制食源性病原菌污染的關鍵。目前，金葡菌的檢測方法主要有BP平板法、免疫學[7-9]、分子生物學快速檢測方法[10-12]等。BP平板法雖成本較低，敏感性好，但檢測時間較長，操作較繁瑣。免疫學、分子生物學檢測方法隨檢測時間短，靈敏度高，但是對于技術人員操作要求較高，不能完全普及。本試驗利用金黃色葡萄球菌自身生化特性優(yōu)化培養(yǎng)基，通過代謝而產(chǎn)生特異性酶或其他特異性物質，在培養(yǎng)基中添加相應的顯色底物，使菌落呈現(xiàn)特定的顏色實現(xiàn)分離和鑒別。通過無紡布、冷凝膠、塑料薄膜等作為培養(yǎng)基的載體，將以上材料組裝成金黃色葡萄球菌的測試片，縮短了檢測時間、降低了勞動強度、節(jié)約成本。

1 試驗

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌標株，大腸桿菌標株、陰溝腸桿菌標株、鼠傷寒沙門菌標株：北京良潤實驗室提供；蛋白胨、酵母粉，丙酮酸鈉，甘氨酸，氯化鈉，氯化鋰，亞碲酸鉀，苯乙醇，聚丙烯酰胺，瓜爾膠。

1.2 儀器與設備

DHP-9272B恒溫培養(yǎng)箱，PHSJ-3F精密pH計，BHC-1300IIA 2無菌操作臺，KLC-08拍擊式均質器，TDL-80-2B離心機。

1.3 方法

1.3.1 測試片的制備

選定三種膜和無紡布組合在一起。上膜材料PP，氧氣可以自由通過，無色透明，不抑制生物生長；無紡布吸水性較強，棉質較高，不影響生物生長。中膜材料PEP，對生物沒有抑制作用；下膜是合成的硬紙，主要作用是保持平整，起支撐作用；將聚丙烯酰胺與瓜爾膠按1:4混合與培養(yǎng)基混勻放在無紡布上進行烘干，再將上模、無紡布、中膜、下膜安裝在一起。

1.3.2 培養(yǎng)基單因素試驗

基礎培養(yǎng)基，蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，定容1 L，調整最適p H 7.4，添加促進金黃色葡萄球菌生長的物質蛋白胨、酵母粉、丙酮酸鈉、甘氨酸，測定金黃色葡萄球菌的總數(shù)，將菌落總數(shù)轉化成對數(shù)值(LogCFU)進行統(tǒng)計分析。抑制其他菌生長的物質氯化鈉、氯化鋰、亞碲酸鉀、苯乙醇，測定金黃色葡萄球菌，沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌菌落數(shù)。

1.3.3 培養(yǎng)基正交設計試驗

根據(jù)單因素試驗結果，采用L27(38)正交表，設計8因素3水平的正交試驗，各因素試驗水平見表1。將金黃色葡萄球菌標準菌株接種培養(yǎng)18-24 h，以國標方法作為對照。

表1 正交試驗設計表

1.3.4 測試片和BP平板檢測結果相關性分析

測試片與BP平板上金黃色葡萄菌菌落數(shù)做對比，進行方差分析，為便于統(tǒng)計分析，采用直觀菌落數(shù)作為統(tǒng)計量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗用SPSS、statistix 8.1軟件對試驗進行設計及數(shù)據(jù)分析處理。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基單因素試驗

2.1.1 促進劑對金黃色葡萄球菌的影響

表2中同列不同字母代表差異性顯著（P〈0.05），相同字母代表差異性不顯著(P〉0.05)，蛋白胨為金黃色葡萄球菌的生長提供氮源，同時起到緩沖作用，隨著蛋白胨濃度的升高，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)先升高，在16 g/L后差異性不顯著，因此從節(jié)約角度出發(fā)，為了節(jié)省能源，和考慮到其它雜菌的生長情況，正交試驗蛋白胨濃度選定12、16、20 g/L。酵母粉能促進金黃色葡萄球菌生長及修復。酵母粉濃度在3 g/L后差異性不顯著，菌落總數(shù)基本保持不變，因此選定2、3、4 g/L。丙酮酸鈉能促進金黃色葡萄球菌生長,并能增進選擇性,同時可補償由抑制劑引起的細胞損傷[13]。丙酮酸鈉濃度在6 g/L時，金黃色葡萄球菌的菌落總數(shù)達到最高，濃度的增加差異性影響不顯著，因此正交試驗濃度選定4、6、8 g/L。甘氨酸能夠促進金黃色葡萄球菌生長，并對其它雜菌沒有促進作用。當甘氨酸濃度達到10 g/L，甘氨酸濃度的增加對菌落總數(shù)差異性影響不顯著，因此選定正交試驗濃度為7.5、10、12.5 g/L。

2.1.2 抑制劑對金黃色葡萄球菌及其它細菌的影響

金葡菌具有高度的耐鹽性，隨著氯化鈉濃度增加，對金葡菌之外的其他細菌都具有抑制作用。氯化鋰濃度的變化，對金黃色葡萄球菌和沙門菌影響較小，但對大腸桿菌和志賀氏菌的有較強的抑制作用。亞碲酸鉀對金黃色葡萄球菌生長影響不大，但對其他菌都具有一定的抑制作用。由于苯乙醇能夠阻礙革蘭氏陰性菌的DNA合成，從而對革蘭氏陰性菌有抑制作用，對革蘭氏陽性菌生長無影響。通過單因素試驗結果同時考慮培養(yǎng)基的培養(yǎng)性能，確定正交試驗氯化鈉選定濃度為10、15、20 g/L，亞碲酸鉀20、30、40 g/L，氯化鋰3、5、7 g/L，苯乙醇3、5、7 g/L。

圖1 氯化鈉的影響

圖2 氯化鋰的影響

圖3 亞碲酸鉀的影響

表2 增菌劑對金黃色葡萄球菌的影響

圖4 苯乙醇的影響

2.2 正交設計試驗

在培養(yǎng)基中加入抑制劑的作用是抑制非目標菌的生長，但不可避免的會對目標菌產(chǎn)生一定的影響，因此需要加入一些促進劑，使目標菌得到一定程度的保護和修復。為了進一步優(yōu)化培養(yǎng)基的配方，確定促進劑和抑制劑的添加比例，本試驗進行了以下8因素3水平的正交試驗。根據(jù)正交試驗結果可以看出亞碲酸鉀和苯乙醇對金葡菌的生長影響最大。其次氯化鋰〉氯化鈉〉酵母粉〉蛋白胨〉丙酮酸鈉〉甘氨酸。結合極差分析，選擇水平A3B2C3D3E1F1G2H1，基礎培養(yǎng)基的配方確定為：蛋白胨20 g/L、酵母粉3 g/L、丙酮酸鈉8 g/L、甘氨酸12.5 g/L、氯化鈉20 g/L、氯化鋰5 g/L、亞碲酸鉀40 m g/L、苯乙醇3 m l/L。

表3 正交試驗結果

2.3 測試片和BP平板檢測結果相關性

由圖5所知，測試片法和國標方法檢測結果相關性較好，R2=0.994。說明金黃色葡萄球菌完全可以用測試片法進行檢測。

圖5 測試片和BP金黃色葡萄球菌相關性

3 結論

以無紡布、冷凝膠、塑料薄膜等作為培養(yǎng)基的載體，通過促進劑和抑制劑單因素和正交試驗確定培養(yǎng)基的最佳配方。測試片與傳統(tǒng)的檢驗方法相比具有試驗周期短、儀器簡單、特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡便等優(yōu)點。