付玉潔，鄭從森，陳曉良，葉 豐，鐘浩杰，趙 欣，李鵬升，杜修賢

(沈陽工學(xué)院 生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122)

現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖戶為充分利用土地建筑資源、增加經(jīng)濟(jì)效益，追求高密度、高生長速度，加之在動物飼養(yǎng)和疾病診治中不合理的抗生素使用，使動物長期處于高應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體出現(xiàn)免疫力低下和抗生素相關(guān)性腹瀉(AAD)等問題，降低其生長性能。目前研究表明使用頭孢拉定和慶大霉素抗生素混合液對小鼠造模能夠?qū)е缕淠c道菌群多樣性降低及真菌等部分致病菌的異常增殖[1-2]，并對腸粘膜造成典型三度菌群失調(diào)[3]，引起AAD癥狀。近些年對于益生菌的研究表明，飼喂益生菌具有幫助動物恢復(fù)腸道屏障的完整性和功能、增加腸粘液、改善腸道先天免疫、減少腹瀉、中和腸毒素、促進(jìn)營養(yǎng)消化能力、活化全身免疫系統(tǒng)、促進(jìn)抗炎反應(yīng)、刺激動物的特異性或非特異性免疫等作用[4-6]。因此，采取益生菌制劑對動物機(jī)體腸道微生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)管理，在緩沖腸道應(yīng)激、預(yù)防腹瀉、糾正AAD、激發(fā)生長潛力、提高生長性能等方面很受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以“好氧菌、兼性好氧菌、厭氧菌”為復(fù)配原則，復(fù)配成3種復(fù)合益生菌，即Ⅰ號復(fù)合益生菌(腸膜芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、丁酸梭菌)，Ⅱ號復(fù)合益生菌(腸膜芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、丁酸梭菌)，Ⅲ號復(fù)合益生菌(腸膜芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌、丁酸梭菌)。對比研究補(bǔ)充3種復(fù)合益生菌對菌群失調(diào)模型小鼠的補(bǔ)償生長和免疫功能的影響，為益生菌在畜禽促生長和提升免疫力應(yīng)用中提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑70只25日齡，體質(zhì)量17 g～20 g的SPF級昆明鼠，雌雄各半，購自遼寧長生生物有限公司；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulansDH156)、丁酸梭菌(Clostetidium butyricumQA-08)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeBLNJ03)購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；屎腸球菌(Enterococcus faeciumR-026)、腸膜芽孢桿菌(Bacillus mesentericus TO-A)、糞腸球菌(Streptococcus faecalisT-110)由沈陽工學(xué)院動物科學(xué)教研室保留菌種；硫酸慶大霉素購自河南潤宏制藥股份有限公司(批號：1707111)；頭孢拉定購自廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司(批號：2160032)；營養(yǎng)肉湯、YEPD液體培養(yǎng)基、MRS肉湯、腦心浸液肉湯等均購自青島海博生物科技有限公司；綿羊壓積紅細(xì)胞(SRBC)、豚鼠血清(實(shí)驗(yàn)室自制)；氫化可的松、SA緩沖液等均購自上海善然生物科技有限公司；都氏試劑購自Sigma公司；印度墨汁購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 復(fù)合益生菌制備取好氧菌(腸膜芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌)、兼性厭氧菌(糞腸球菌、屎腸球菌、釀酒酵母、植物乳桿菌)、厭氧菌(丁酸梭菌)等純化菌種復(fù)壯后，用液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，平板計數(shù)后4℃保存(每周純培養(yǎng)1次)。用時離心收集菌體，用生理鹽水按配方調(diào)整菌數(shù)，即：Ⅰ號復(fù)合益生菌(腸膜芽孢桿菌 0.5×108cfu/mL、凝結(jié)芽孢桿菌 0.4×108cfu/mL、屎腸球菌 1×108cfu/mL、糞腸球菌 1×108cfu/mL、丁酸梭菌4.6×108cfu/mL)；Ⅱ號復(fù)合益生菌(腸膜芽孢桿菌0.5×108cfu/mL、凝結(jié)芽孢桿菌0.4×108cfu/mL、糞腸球菌 1×108cfu/mL、植物乳桿菌 1×108cfu/mL、丁酸梭菌 4.6×108cfu/mL)；Ⅲ號復(fù)合益生菌(腸膜芽孢桿菌0.5×108cfu/mL、凝結(jié)芽孢桿菌 0.4×108cfu/mL、釀酒酵母 3×108cfu/mL、植物乳桿菌 1×108cfu/mL、丁酸梭菌 4.6×108cfu/mL)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物預(yù)處理70只SPF級昆明鼠，適應(yīng)飼養(yǎng)4 d后，參照文獻(xiàn)[2-3]進(jìn)行菌群失調(diào)造模，取14只小鼠灌胃生理鹽水作為正常組，另取56只小鼠灌胃頭孢拉定和慶大霉素抗生素混合液構(gòu)建菌群失調(diào)模型，均按劑量0.35 mL/次，2次/d，連續(xù)5 d，直至造模小鼠全部出現(xiàn)糞便稀軟等AAD癥狀。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計將預(yù)處理模型小鼠分為5組，每組14只(雌雄各半)，即正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組、實(shí)驗(yàn)Ⅲ組。各組小鼠給予復(fù)合益生菌的方式、灌胃體積和天數(shù)，見表1。實(shí)驗(yàn)期為30 d，在第20 d時參照文獻(xiàn)[7]方法，對除正常組外各組模型小鼠進(jìn)行HY免疫抑制，即自第20 d時隔天1次，連續(xù)5次對小鼠肌內(nèi)注射40 mg/kg HY；飼養(yǎng)條件控制在22℃～24℃，自然照明，自由飲水和采食。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 1 Experimental design

1.5 小鼠周平均增重測定實(shí)驗(yàn)期間每周測定一次各組小鼠的體質(zhì)量并計算其體質(zhì)量差值。

1.6 小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和脾指數(shù)測定實(shí)驗(yàn)第29 d，參照文獻(xiàn)[7]按0.1 mL/10 g尾靜脈注射印度墨汁后，立刻計時，在第2 min和10 min(t2、t10)時尾尖取血 20 μL，混入 1 mL Na2CO3溶液，測其A600nm值。迫殺小鼠，取其脾臟、肝臟稱重。計算單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和脾指數(shù)：單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)=體重/(脾重+肝重)×K1/3，K=(lgA1-lgA2)/(t2-t10)；脾指數(shù)(mg/kg)=脾重/體重。

1.7 綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠足跖增厚度測定在第25 d，參照文獻(xiàn)[7]，按隨機(jī)數(shù)字表法在每組分別選定6只小鼠(雌雄各半)，每只鼠腹腔注射0.2 mL 2%(v/v)SRBC致敏。SRBC免疫第5 d測定SRBC致敏小鼠的右后足跖部厚度后，于該處皮下注射20 μL 20%(v/v)SRBC，24 h后用游標(biāo)卡尺測量由遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)引起的右后足跖部厚度。公式：足跖增厚(mm)=注射后厚度值-注射前厚度值。

1.8 小鼠半數(shù)溶血值(HC50)測定在第30 d，參照文獻(xiàn)[7]，眼球采血迫殺SRBC致敏小鼠，分離血清，取血清20 μL，加 SA液4 mL，取稀釋后血清1 mL置于試管，依次加0.5 mL 10%SRBC、1 mL補(bǔ)體(用SA液1∶8稀釋)，另設(shè)不加血清對照管。37℃恒溫水浴20 min后，冰浴終止反應(yīng)。2 000 r/min，10 min離心取上清1 mL，加都氏試劑 3 mL。同時設(shè)半數(shù)溶血對照管，分別加0.25 mL 10%SRBC、3.75 mL都氏試劑，充分混勻，靜置10 min。于540 nm處測定吸收度(ABS)值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，采用SPSS24.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，方差不齊的數(shù)據(jù)選擇非參數(shù)檢驗(yàn)分析，p＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合益生菌對菌群失調(diào)模型小鼠的補(bǔ)償生長作用連續(xù)30 d灌胃復(fù)合益生菌，記錄各組小鼠平均周增重。結(jié)果顯示，各益生菌實(shí)驗(yàn)組小鼠給藥后第1周平均周增重均顯著高于模型組和正常組(p＜0.05)。各實(shí)驗(yàn)組小鼠第2周、第3周平均周增重組間差異不顯著(p＞0.05)，但各益生菌實(shí)驗(yàn)組小鼠平均周增重優(yōu)于正常組和模型組，呈增長趨勢。第4周時經(jīng)HY處理的各實(shí)驗(yàn)組小鼠平均周增重均極顯著低于正常組(p＜0.01)，其中補(bǔ)充Ⅰ號和Ⅱ號復(fù)合益生菌的試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組小鼠平均周增重顯著高于模型組(p＜0.05)(圖1)。以上結(jié)果表明持續(xù)補(bǔ)充3種復(fù)合益生菌均能夠有效促進(jìn)菌群失調(diào)小鼠生長，幫助重建腸道菌群，增強(qiáng)小鼠消化機(jī)能，其中Ⅰ號和Ⅱ號復(fù)合益生菌能夠有效減輕因免疫抑制應(yīng)激導(dǎo)致的負(fù)生長，幫助小鼠恢復(fù)體質(zhì)。

圖1 各組小鼠平均周增重比較(±SD，n=14)Fig.1 Comparison of the average weekly gain of the mice in each group(±SD,n=14)

2.2 復(fù)合益生菌對菌群失調(diào)模型小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和脾指數(shù)的影響末次肌注HY后次日，即給藥第29 d時測定各組小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和脾指數(shù)。結(jié)果顯示，末次肌注HY第2 d，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和脾指數(shù)均極顯著低于正常組(p＜0.01)，表明菌群失調(diào)模型小鼠機(jī)體免疫力處于低下狀態(tài)。各益生菌實(shí)驗(yàn)組小鼠的單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)均優(yōu)于模型組，其中試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于模型組(p＜0.05)。各益生菌實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾指數(shù)均顯著高于模型組(p＜0.01或p＜0.05)(圖2)。以上結(jié)果表明持續(xù)補(bǔ)充3種復(fù)合益生菌均可顯著促進(jìn)免疫低下的菌群失調(diào)模型小鼠脾臟發(fā)育，其中Ⅰ號復(fù)合益生菌能夠顯著提高模型小鼠的單核巨噬細(xì)胞吞噬功能，具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。

2.3 復(fù)合益生菌對菌群失調(diào)模型小鼠足跖增厚度和HC50的影響于SRBC免疫第5 d，即第給藥30 d時測定各組小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)-足跖增厚度和HC50。結(jié)果顯示，經(jīng)SRBC免疫第5 d時，經(jīng)HY處理的各實(shí)驗(yàn)組小鼠足跖增厚度和HC50均顯著低于正常組(p＜0.05)，表明菌群失調(diào)模型小鼠機(jī)體免疫力處于低下狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組小鼠的足跖增厚度顯著高于模型組(p＜0.05)。各益生菌實(shí)驗(yàn)組小鼠的HC50顯著或者極顯著高于模型組(p＜0.05或p＜0.01)(圖3)。表明持續(xù)補(bǔ)充3種復(fù)合益生菌均能夠顯著提高模型小鼠血清中抗SRBC抗體(溶血素)水平，其中Ⅰ號、Ⅱ號復(fù)合益生菌能有效增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，具有提升小鼠細(xì)胞免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫功能的作用。

圖2 各組小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定(±SD，n=8)Fig.2 Determination of the mononuclear-macrophage phagocytic index and spleen index in each group(±SD,n=8)

圖3 各組小鼠足跖增厚度和血清溶血素水平的測定(±SD，n=6)Fig.3 Determination of the foot swelling and serum hemolysin in each group(±SD,n=6)

3 討論

越來越多的研究表明飼料中添加復(fù)合益生菌劑能夠顯著提高動物生長性能[8-10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)抗生素菌群失調(diào)造模后，造模小鼠持續(xù)服用3種復(fù)合益生菌均能夠顯著促進(jìn)其補(bǔ)償性生長。表明給抗生素誘導(dǎo)的菌群失調(diào)模型小鼠灌胃復(fù)合益生菌后，復(fù)合菌劑中好氧芽孢桿菌、兼性厭氧菌能快速增殖消耗腸內(nèi)氧氣，營造厭氧環(huán)境，與厭氧丁酸梭菌共同促進(jìn)腸道原厭氧益生菌增殖，快速補(bǔ)償缺失的益生菌種類及數(shù)量，與病原菌競爭粘附位點(diǎn)和營養(yǎng)物質(zhì)，重建腸道內(nèi)環(huán)境菌群平衡，增強(qiáng)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)吸收，有效補(bǔ)償模型小鼠的生長。此外，本研究結(jié)果顯示，給藥第4周時經(jīng)HY處理的各實(shí)驗(yàn)組小鼠平均周增重均極顯著低于正常組(p＜0.01)，其中補(bǔ)充Ⅰ號和Ⅱ號復(fù)合益生菌的實(shí)驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組小鼠平均周增重顯著高于模型組(p＜0.05)，其中實(shí)驗(yàn)Ⅲ組小鼠體質(zhì)量下降明顯。表明注射HY免疫抑制的菌群失調(diào)模型小鼠，需要消耗一定能量抵抗免疫抑制應(yīng)激和維持腸道菌群平衡而導(dǎo)致體質(zhì)量減輕。而補(bǔ)充益生菌的各實(shí)驗(yàn)組，能有效維持小鼠重建的腸道菌群平衡，增強(qiáng)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)吸收，抵抗應(yīng)激反應(yīng)。其中補(bǔ)充含釀酒酵母的Ⅲ號復(fù)合菌試驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量下降明顯，可能是模型小鼠處于免疫抑制狀態(tài)時，腸道酵母菌過度生長，轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)會致病菌進(jìn)而影響小鼠生長，如Llopis等研究表明從22種商業(yè)產(chǎn)品中分離出的商品編號為 D2、D4、D14的釀酒酵母菌株，經(jīng)靜脈接種和口服接種抗生素治療(損傷胃腸粘膜)和地塞米松免疫抑制治療的模型小鼠，表現(xiàn)出不同程度致病性，表明釀酒酵母是一種機(jī)會致病菌[11]。因此，關(guān)于本實(shí)驗(yàn)中Ⅲ號復(fù)合菌中釀酒酵母在菌群失調(diào)小鼠經(jīng)歷免疫抑制后是否表現(xiàn)出機(jī)會致病性、其增益作用如何、腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和豐度變化等尚需進(jìn)一步研究確定。

非特異性免疫，是機(jī)體始終開啟的以提供快速保護(hù)的先天性免疫，也是特異性免疫的基礎(chǔ)。脾臟被認(rèn)為是血液源抗原的專職淋巴結(jié)，入侵血液的異物能夠被迅速激活的血液單核-巨噬細(xì)胞全部捕獲而清除。常將脾指數(shù)、單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)作為評價非特異性免疫功能的指標(biāo)[7]。史自濤等研究顯示飼喂糞腸球菌能顯著促進(jìn)斷奶仔豬肝臟和脾臟的發(fā)育[12]，Strompfova等研究表明糞腸球菌可顯著提高血清中總蛋白含量和白細(xì)胞吞噬指數(shù)[13]，Dvoro?ňáková等研究表明飼喂(屎腸球菌、腸球菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌)復(fù)合菌能顯著提高感染旋毛蟲小鼠第1至3周內(nèi)的血液白細(xì)胞吞噬活性[14]。本研究結(jié)果顯示，持續(xù)口服3種復(fù)合益生菌均能顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)，其中Ⅰ號復(fù)合益生菌能顯著升高其單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)，具有增強(qiáng)模型小鼠非特異性免疫力的作用。原因可能是益生菌及其代謝產(chǎn)物中免疫激活物質(zhì)作為免疫調(diào)節(jié)劑，通過刺激胃腸道免疫反應(yīng)增加上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的數(shù)量，提高巨噬細(xì)胞吞噬活性和刺激抗體產(chǎn)生來幫助免疫系統(tǒng)發(fā)育[2]，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠機(jī)體的非特異免疫功能。

特異性免疫，又稱獲得性免疫，包括由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，二者相輔相成，為機(jī)體提供最后的免疫防御。通過測定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)-足跖增厚度和血清溶血素水平是評價機(jī)體細(xì)胞免疫功能、體液免疫狀態(tài)的常用方法[7]。據(jù)報道，益生菌能夠調(diào)節(jié) NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌各種細(xì)胞免疫分子，參與炎癥反應(yīng)，提高T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活力，啟動特異性免疫應(yīng)答[15-16]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組小鼠的足跖增厚度顯著高于模型組(p＜0.05)，各益生菌實(shí)驗(yàn)組小鼠的HC50顯著或者極顯著高于模型組(p＜0.01或p＜0.05)。與潘香香等的復(fù)合益生菌(植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、干酪乳桿菌)能顯著提高小鼠特異性免疫功能結(jié)果相似[17]。表明持續(xù)補(bǔ)充3種復(fù)合益生菌均能顯著提高模型小鼠血清中抗SRBC抗體(溶血素)水平，其中Ⅰ號、Ⅱ號復(fù)合益生菌能有效增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。相比之下，持續(xù)補(bǔ)充Ⅰ號和Ⅱ號復(fù)合益生菌，更有助于限制免疫抑制狀態(tài)下的造模小鼠腸內(nèi)真菌的過度增殖，降低真菌逃避宿主防御機(jī)制并表現(xiàn)出機(jī)會性感染的幾率，維持原有腸道微生態(tài)系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)；同時各正常菌群包括口服的益生菌能夠充當(dāng)免疫佐劑，活化腸道管壁內(nèi)彌散性淋巴組織，使SIgA分泌增強(qiáng)，提高免疫識別力，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，通過淋巴細(xì)胞再循環(huán)而活化全身免疫系統(tǒng)[18]，增強(qiáng)宿主免疫功能。

綜上所述，補(bǔ)充復(fù)合益菌Ⅰ號和Ⅱ號對模型小鼠的補(bǔ)償生長、單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能、足趾增厚度、血清溶血素水平的增強(qiáng)效果優(yōu)于含釀酒酵母的Ⅲ號復(fù)合菌，并且顯著高于正常組和模型組。表明采用復(fù)合益生菌Ⅰ號和Ⅱ號對畜禽腸道微生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)管理，能有效糾正AAD，緩解機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，提升機(jī)體免疫力，提高生長性能的作用。此外，本研究仍需從3種復(fù)合益生菌在菌群失調(diào)小鼠經(jīng)歷免疫抑制后其腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和豐度變化、釀酒酵母是否具表現(xiàn)機(jī)會致病性、對其腸道絨毛和隱窩影響等方面進(jìn)一步研究確定。