李如松，王建峰*，倪健波，黃素文，鄭 劍，趙秀玲，陳先鋒，黃紹棠

(1.寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 寧波 315100；2.湖北檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖北 武漢430050)

幼蟲(chóng)芽孢桿菌(Paenibacillus larvae)是一種革蘭氏陽(yáng)性類(lèi)芽孢桿菌，具有極強(qiáng)的生命力，可在蜂蜜[1]、蜂王漿、蜂膠和蜂花粉中存活，可引起美洲幼蟲(chóng)腐臭病(American foulbrood，AFB)。AFB是一種主要侵害蜜蜂幼蟲(chóng)和蜂蛹的急性毀滅性傳染病，一旦發(fā)生極易造成蜂群衰弱及死亡，很難徹底清除，給養(yǎng)蜂業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。在曾經(jīng)暴發(fā)過(guò)該病的養(yǎng)蜂區(qū)域能存活長(zhǎng)達(dá)35年，因此該病被OIE列入OIE疫病名錄(OIE-listed iseases)，為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病[3]。通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)目前蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)主要關(guān)注質(zhì)量、安全、真實(shí)性等相關(guān)的指標(biāo)，而忽略了蜂蜜可以傳播美洲幼蟲(chóng)腐臭病的風(fēng)險(xiǎn)[4]，因此本研究對(duì)進(jìn)口蜂蜜進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)分離株的16S rRNA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)口蜂蜜風(fēng)險(xiǎn)控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及主要試劑2017年度寧波地區(qū)進(jìn)口蜂蜜樣品71份，分別來(lái)自加拿大、澳大利亞、西班牙等10個(gè)國(guó)家和地區(qū)。MYPGP培養(yǎng)基(Mueller-Hinton broth、酵母抽提物、K2HPO4、丙酮酸鹽、葡萄糖)由本實(shí)驗(yàn)室配置并添加吡哌酸和萘啶酮酸；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定按照OIE《陸生動(dòng)物診斷實(shí)驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》2017版2.02.02的方法進(jìn)行分離，蜂蜜樣品加熱至45℃～50℃，PBS或生理鹽水稀釋?zhuān)?0℃處理10 min。離心棄上清液，留下約 3 mL液體，混勻后，取懸液 200 μL涂布于MYPGP平板，37℃培養(yǎng)7 d～8 d，挑選可疑菌落進(jìn)行純化、觀察菌落形態(tài)、鏡檢和生化鑒定，生化鑒定參照國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1681-2011[5]。

1.3 16S rRNA基因擴(kuò)增和序列分析按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)，提取細(xì)菌DNA作為模板，參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道合成引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增其16S rRNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由上海派森諾生物科技有限公司測(cè)序，利用Blast和DNAStar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌的分離鑒定對(duì)采集的蜂蜜樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，在71份蜂蜜樣品中共分離到菌株31株，詳見(jiàn)表 1，陽(yáng)性率達(dá)到 43.6%(31/71)。分離菌在MYPGP平板上觀察到整齊、粗糙、扁平或突起的灰白色小菌落(圖1A)，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性桿菌(圖1B)。生化反應(yīng)結(jié)果與國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[5]結(jié)果一致(表1)。表明分離得到的細(xì)菌為幼蟲(chóng)芽孢桿菌。

圖1 分離株培養(yǎng)性狀觀察Fig.1 The characters of the isolates

2.2 16S rRNA基因鑒定和序列分析細(xì)菌16S rRNA基因序列具有相對(duì)穩(wěn)定和易變異的雙重特點(diǎn)，常用于細(xì)菌的分類(lèi)鑒定，Dirk Gevers等的研究結(jié)果表明菌株之間16S rRNA的序列同源性≥97%的才有可能是同種細(xì)菌[7]。31株分離細(xì)菌的PCR產(chǎn)物約為1 400 bp(圖略)，經(jīng)測(cè)序及比對(duì)分析結(jié)果顯示所有菌株的16S rRNA基因序列與P.larvae(ATCC9545)等標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性大于97%，可以判定這些菌株均為幼蟲(chóng)芽孢桿菌。

16S rRNA序列變化是微生物的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化的重要的指示之一，本研究利用DNAStar軟件中MegAlign對(duì)包括 31株分離株(分別來(lái)自于澳大利亞、法國(guó)，韓國(guó)、加拿大、羅馬尼亞、臺(tái)灣、西班牙、希臘、新西蘭、匈牙利)、3株ATCC保藏菌株(ATCC13537、ATCC25368、ATCC9545)，1 株 DSM保藏菌株(DSM3615)進(jìn)行核苷酸比對(duì)和同源性分析。結(jié)果顯示31株分離菌的16S rRNA核苷酸序列同源性為99.8%～100%，具有較高的保守性和穩(wěn)定性，遺傳變異較低。基于該基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，35株分離菌分成2個(gè)大分支，ATCC9545單獨(dú)一支，其原因可能是GenBank中ATCC9545的16S rRNA中存在多個(gè)兼并堿基原因。加拿大分離株(4株)、韓國(guó)分離株(1株)、臺(tái)灣分離株(1株)、澳大利亞分離株(1株)在同一分支；法國(guó)分離株(1株)和新西蘭分離株(1株)在同一分支(圖2)，由此表明幼蟲(chóng)芽孢桿菌的16S rRNA比較保守，聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)基因差異較小，不適宜用作區(qū)分不同地理來(lái)源分離株的分子遺傳標(biāo)記。

表1 31株分離的幼蟲(chóng)芽孢桿菌生化特性Table 1 Detection of the biochemical characters of 31 P.larvae isolates

圖2 35株幼蟲(chóng)芽孢桿菌16S rRNA進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree base on 16S rRNA sequences of P.larvae isolates