王婉蓉，代 科，馬小雨，楊 振，曹三杰，黃小波，趙 勤，伍 銳，文翼平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，四川 成都611130)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是一種條件性致病菌，隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，HPS病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病之一，該病近年來(lái)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。使用抗生素是目前控制和治療HPS病的重要措施，但也引起了HPS耐藥性的問(wèn)題。該致病菌極易對(duì)鏈霉素(Streptomycin，SM)產(chǎn)生耐藥。SM通過(guò)與結(jié)核分枝桿菌和球形芽孢桿菌等16S rRNA(rrs基因編碼)和核糖體蛋白S12(rpsL基因編碼)結(jié)合造成其核糖體合成異常或產(chǎn)生無(wú)功能的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)菌新陳代謝等生命活動(dòng)障礙[2]。目前關(guān)于SM抗性的研究報(bào)道主要見(jiàn)于結(jié)核分枝桿菌，大多數(shù)SM抗性突變體的產(chǎn)生是由于rpsL基因錯(cuò)義突變?cè)斐傻?，其中，K43R和K88R是較常見(jiàn)的突變，與高水平的耐藥性有關(guān)[3-7]。本研究采用甲基磺酸乙酯(EMS)對(duì)HPS進(jìn)行化學(xué)誘變。EMS是一種廣泛用于誘導(dǎo)植物和細(xì)菌整個(gè)基因組隨機(jī)突變的化學(xué)誘變劑，可以導(dǎo)致單一堿基對(duì)改變而形成點(diǎn)突變[8]。利用EMS的高頻隨機(jī)突變特性和相應(yīng)的篩選、測(cè)序方法，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)造成相應(yīng)表型差異的分子基礎(chǔ)(基因突變位點(diǎn))，例如Redfield團(tuán)隊(duì)采用EMS對(duì)低自然轉(zhuǎn)化頻率的流感嗜血桿菌KW20進(jìn)行誘導(dǎo)和篩選，多次發(fā)現(xiàn)了提高自然轉(zhuǎn)化頻率的基因突變位點(diǎn)[9-10]。

現(xiàn)已有較多關(guān)于細(xì)菌對(duì)SM耐藥性分子機(jī)制的相關(guān)報(bào)道，而關(guān)于HPS SM耐藥性的分子機(jī)制還鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)EMS誘導(dǎo)并篩選SM抗性突變體，然后對(duì)轉(zhuǎn)化子的rpsL和rrs基因進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定SM抗性突變位點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道的其它細(xì)菌的SM抗性點(diǎn)突變位置進(jìn)行比對(duì)，判斷HPS的SM抗性位突變來(lái)源是否與研究的其它細(xì)菌的突變情況一致；采用位點(diǎn)引導(dǎo)性點(diǎn)突變技術(shù)及自然轉(zhuǎn)化法對(duì)HPS的rpsL基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，并通過(guò)對(duì)該突變株SM抗性水平檢測(cè)以進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的點(diǎn)突變與SM抗性的關(guān)聯(lián)性，為完善HPS耐SM分子機(jī)制的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑HPS SC1401由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心分離、鑒定并保存；pK18mobSacB自殺質(zhì)粒培養(yǎng)在大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購(gòu)自美國(guó)BD公司；LA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購(gòu)自Hopebio公司；新生牛血清購(gòu)自Gibco公司；添加有新生牛血清和NAD的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA++)、添加有新生牛血清和NAD的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB++)均購(gòu)自Difco公司；硫酸卡那霉素(100 mg/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)購(gòu)自TIANGEN公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD)購(gòu)自 TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒(E.Z.N.ATMPlasmid Miniprep Kit)、細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；誘導(dǎo)劑甲基磺酸乙酯(EMS)購(gòu)自BIOSHARP公司；點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 HPS野生型菌株對(duì)SM最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定無(wú)菌配制16 384 μg/mL的SM儲(chǔ)存液，參照文獻(xiàn)[11]，采用96孔板和2倍倍比稀釋法測(cè)定HPS SC1401對(duì)SM的MIC、MBC值，其中，測(cè)定MBC時(shí)SM的濃度梯度為8 μg/mL～8 192 μg/mL。

1.3 HPS最適EMS誘變濃度的篩選無(wú)菌條件下，將HPS SC1401菌株劃線接種于TSA++平板過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于3 mL TSB++，置于空氣搖床過(guò)夜培養(yǎng)制成菌懸液。配制2.68 nmol/L的EMS，將 3 mL菌懸液分別與濃度為 0(對(duì)照組)、1.34 nmol/L、2.68 nmol/L、4.02 nmol/L、5.36 nmol/L(實(shí)驗(yàn)組)的EMS混和，于37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。觀察HPS的生長(zhǎng)情況，以不抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最大EMS濃度作為其最適誘變濃度。

1.4 誘導(dǎo)后的SM抗性突變菌株rpsL和rrs基因的擴(kuò)增及序列分析在SC1401菌液中加入EMS，使其終濃度為1.3中測(cè)定的最適誘變濃度，于37℃搖床培養(yǎng) 12 h～24 h，取 200 μL誘變的第一代細(xì)菌(F1)接種到2 mL新鮮無(wú)抗性的 TSB++中使細(xì)菌的活力得以恢復(fù)，于37℃搖床培養(yǎng)12 h～24 h。采用相同方法誘導(dǎo)得到F2、F3等，一直誘導(dǎo)到F11代。每誘導(dǎo)一代，取150 μL菌液涂布于SM濃度為60 μg/mL(按 1.2中測(cè)定的 MIC結(jié)果)的 TSA++平板上(TSA++SM)，37℃培養(yǎng)12 h～24 h。隨機(jī)挑取平板中的單菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)在SM濃度為100 μg/mL的TSB++肉湯中(TSB++SM)，置37℃搖床培養(yǎng)12 h，對(duì)篩選的能在TSB++SM中生長(zhǎng)的疑是SM突變菌株進(jìn)行突變位點(diǎn)分析。

根據(jù)GenBank登錄的HPS SC1401菌株全基因組(CP015099)中rpsL和rrs基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)rpsL和rrs基因擴(kuò)增引物(表1)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取上述篩選出的不同代次SM抗性突變菌株的基因組。以該基因組為模板分別PCR擴(kuò)增rpsL基因和rrs基因，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 3 min；98℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。PCR產(chǎn)物由海英駿公司測(cè)序。用DNAMAN 6.06軟件對(duì)SM抗性突變菌株的rpsL基因、rrs基因與未突變的HPS SC1401菌株的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定突變位點(diǎn)，對(duì)突變位點(diǎn)與抗性水平之間的關(guān)系進(jìn)行初步分析。

表1 HPS菌株SC1401的rpsL和rrs基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers sequence used in this study

1.5 SM抗性定點(diǎn)突變株的構(gòu)建和PCR測(cè)序分析根據(jù)1.4對(duì)SM抗性菌株rpsL基因與rrs基因的測(cè)序結(jié)果分析后，針對(duì)篩選出來(lái)的SM抗性菌株的rpsL基因點(diǎn)突變位置進(jìn)行人工定點(diǎn)突變，以驗(yàn)證突變菌株產(chǎn)生SM抗性的基因。以HPS SC1401的基因組DNA為模板，采用rpsL-P1/P2引物擴(kuò)增整個(gè)rpsL基因序列并連接到自殺載體pK18mobSacb中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒pkrpsL。參照點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書，采用primer 5.0設(shè)計(jì)突變引物rpsL-43-P1/P2和rpsL-88-P1/P2(表 1)，并通過(guò)反向 PCR獲得用于構(gòu)建rpsL基因特定位點(diǎn)(128號(hào)和263號(hào)位堿基，即rpsL基因ORF第43號(hào)和第88號(hào)位密碼子)突變質(zhì)粒pkrpsL43(A128G)和 pkrpsL88(A263G)。采用自然轉(zhuǎn)化的方法將以上兩種突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到親本株中，產(chǎn)生SM抗性點(diǎn)突變菌株1401D43和1401D88。使用TSA++SM篩選培養(yǎng)，對(duì)該兩株抗體菌株進(jìn)行rpsL基因的PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 SM抗性突變菌株MIC、MBC測(cè)定及抑菌環(huán)試驗(yàn)采用1.2的方法對(duì)EMS誘導(dǎo)產(chǎn)生的F7-1和F8-1(隨機(jī)選取EMS誘導(dǎo)的第7代和第8代SM抗性菌株的其中一株)以及SM定點(diǎn)抗性突變的菌株1401D43、1401D88分別測(cè)定 MIC、MBC。并將其與野生型HPS SC1401MIC、MBC進(jìn)行比較分析。

對(duì)親本株 SC1401和各突變株 CF7-1、F8-1、1401D43及1401D88上適當(dāng)稀釋，保證各組OD600nm相同。取上述100 μL稀釋菌液涂布于TSA++平板，靜置數(shù)分鐘后將平板劃分為兩部分，將牛津杯垂直輕放于區(qū)域中心的瓊脂表面，輕壓使之無(wú)縫接觸。分別將 8 192 μg/mL、4 096 μg/mL的 SM 溶液各100 μL加入牛津杯中，置 37℃培養(yǎng) 12 h～24 h。觀察并測(cè)量各個(gè)菌株抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPS野生菌株SC1401的MIC、MBC測(cè)定結(jié)果通過(guò)二倍倍比稀釋法測(cè)定HPS親本株SC1401對(duì)SM的MIC和MBC，結(jié)果顯示SC1401的MIC為24 μg/mL，MBC 為 32 μg/mL，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中使用濃度為60 μg/mL的 SM對(duì) HPS SC1401篩選SM抗性突變菌株。

2.2 HPS SC1401最適EMS誘變濃度的篩選將系列梯度濃度EMS和HPS混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示高濃度EMS具有較強(qiáng)的抗菌活性。EMS濃度為2.68 nmol/L、4.02 nmol/L、5.36 nmol/L的離心管中未見(jiàn)到絮狀菌，濃度為1.34 nmol/L的離心管中可見(jiàn)絮狀菌，但菌濃度(比濁法)比對(duì)照組(EMS濃度為0)低。表明當(dāng)EMS終濃度高于2.68 nmol/L時(shí)，對(duì)HPS的生長(zhǎng)具有抑制作用，因此誘導(dǎo)HPS SC1401突變的EMS最適濃度為1.34 nmol/L。

2.3 SM抗性突變菌株的篩選及耐藥基因測(cè)序分析以最適濃度1.34 nmol/L的EMS間斷誘導(dǎo)HPS SC1401菌株，經(jīng)過(guò)TSA++SM篩選，顯示 F1、F2、F3和F7至F11代的HPS均產(chǎn)生了SM抗性，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因組提取、rpsL和rrs基因PCR擴(kuò)增以及測(cè)序分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)1、F2、F3代的耐藥菌的rpsL和rrs基因并未發(fā)生突變，而 F7～F11代的SM耐藥菌株均僅rpsL基因發(fā)生突變，突變位點(diǎn)為rpsL基因的第43號(hào)位密碼子和88號(hào)位的密碼子，未發(fā)現(xiàn)其它位點(diǎn)發(fā)生突變，并且也未發(fā)現(xiàn)43號(hào)和88號(hào)密碼子同時(shí)發(fā)生突變的耐藥菌株。突變位點(diǎn)的密碼子由AAA突變?yōu)锳GA，其對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸由Lys(賴氨酸)突變?yōu)锳rg(精氨酸)，這與報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌結(jié)果一致[3]。也未發(fā)現(xiàn)rrs基因發(fā)生突變。盡管HPS與結(jié)核分枝桿菌的rpsL基因僅有58.67%相似性，但其抗SM的分子機(jī)制(突變位點(diǎn)及類型)卻呈現(xiàn)出高度的相似性，表明這兩種細(xì)菌抗SM的分子機(jī)制類似。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析(表2)，在誘變產(chǎn)生的耐藥菌中，rpsL基因中這兩個(gè)區(qū)域比rrs和其它基因位點(diǎn)更容易發(fā)生突變，由此推測(cè)rpsL基因第43號(hào)位和第88號(hào)位密碼子突變是阻礙SM與細(xì)菌核糖體結(jié)合的主要突變位點(diǎn)。雖然有關(guān)報(bào)道表明rrs基因也與SM抗性有關(guān)，但本研究并未在rrs基因中發(fā)現(xiàn)任何突變，這可能是由于該基因突變未能引起高耐藥水平而低于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)限；或該基因突變效率不高而未能有效篩選出來(lái)，因此在HPS中，rrs基因突變是否引起SM耐藥水平的提高以及具體的突變位點(diǎn)和突變類型有待進(jìn)一步研究。F1、F2和F3代SM耐藥菌基因測(cè)序結(jié)果提示，使用EMS誘導(dǎo)得到的前幾代耐藥菌產(chǎn)生的抗性可能不穩(wěn)定，容易回復(fù)至SM敏感水平。

2.4 HPS SM抗性定點(diǎn)突變株的構(gòu)建及突變位點(diǎn)測(cè)序驗(yàn)證對(duì)TSA++SM篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序分析。采用表1中的引物擴(kuò)增1401D43和1401D88的rpsL基因，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果顯示，篩選得到的抗性菌株1401D43和1401D88分別在預(yù)期密碼子位置(rpsL基因ORF第43號(hào)和第88號(hào)位)發(fā)生了點(diǎn)突變，均由AAA突變成了AGA，其編碼的氨基酸殘基由Lys(賴氨酸)變成了Arg(精氨酸)。表明，通過(guò)人工定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)構(gòu)建了SM抗性定點(diǎn)突變株，其突變位置與EMS誘變突變菌株一致。

表2 SM抗性菌株rpsL、rrs基因測(cè)序結(jié)果分析Table 2 Analysis of the sequence of rpsL and rrs of SM resistant strains

2.5 SM抗性突變菌株MIC、MBC及抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)檢測(cè)，EMS誘導(dǎo)的抗性突變株F7-1和F8-1的MIC和MBC均高于8 192 μg/mL，表現(xiàn)出對(duì)SM完全耐藥(表 3)；抗性突變菌株 1401D43、1401D88的 MIC和 MBC同樣高于 8 192 μg/mL，二者表型相符。表明不論是EMS誘變突變菌株還是定點(diǎn)點(diǎn)突變菌株均對(duì)SM完全耐藥。由此判斷HPS的SM耐藥性與rpsL基因突變相關(guān)。1401D43和1401D88與EMS誘變突變菌株表型一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了rpsL基因第43號(hào)位和第88號(hào)位密碼子突變與SM抗性產(chǎn)生有關(guān)。

表3 HPS對(duì)SM的MIC、MBC測(cè)定結(jié)果Table 3 Detection of MIC and MBC of H.parasuis strains to SM

抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果顯示抗性突變菌株F7-1、F8-1、1401D43和1401D88可以在置有SM溶液濃度為8 192 μg/mL 和 4 096 μg/mL 牛津杯的 TSA++上形成完整的菌苔，而親本菌株SC1401則形成了直徑為40 mm的抑菌環(huán)(圖1)，表明突變菌株比親本株SM的抗性更高。由此推測(cè)rpsL基因第43號(hào)位密碼子和第88號(hào)位密碼子的突變和高SM抗性有關(guān)，這與巴塞羅那地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌的研究結(jié)果類似[12]。這兩個(gè)位點(diǎn)的突變很有可能是導(dǎo)致SM耐藥的主要原因。

圖1 SM抗性突變菌株抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Inhibition ring test of SM resistant strains

本研究建立了EMS間歇誘導(dǎo)HPS突變的方法，并篩選出導(dǎo)致HPS對(duì)SM完全耐藥的主要突變位點(diǎn)。結(jié)果顯示，HPS的SM抗性主要由HPSrpsL基因第43號(hào)和第88號(hào)密碼子突變引起，初步判斷這種突變導(dǎo)致HPS核糖體蛋白S12翻譯異常，致使HPS對(duì)SM耐藥性的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HPS采用EMS誘導(dǎo)產(chǎn)生SM抗性菌株的方法和定點(diǎn)突變產(chǎn)生SM抗性菌株的方法為該菌的遺傳操作提供了新的參考，同時(shí)為完善HPS SM耐藥性的分子研究提供一定的參考依據(jù)。