雷志強(qiáng)，劉冰靨， 張 丁，魯波勇，韓 莉，王德成,6*

(1.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 感染與炎癥損傷研究所，湖北 宜昌 443002；3.武穴市第一人民醫(yī)院，湖北 武穴 435400；4.三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院 ＆ 宜昌市中心人民醫(yī)院病理科，湖北 宜昌 443003；5.宜昌市第三人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443003；6.天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué))，湖北 宜昌 443002)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，KP)廣泛分布于自然界，是主要定居在人和動物呼吸道、腸道等部位及環(huán)境中的一種重要機(jī)會致病菌，可以引起人和動物的多種感染。作為一種人獸共患病原菌，KP不僅是醫(yī)院與社區(qū)感染的重要致病菌之一，而且也能造成免疫功能低下或免疫抑制動物的各種炎癥，如肺炎、子宮炎、乳腺炎及其它化膿性炎癥，對養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。此外，楊帆等研究發(fā)現(xiàn)，從豬、雞、犬和兔子等動物分離的KP菌株有較強(qiáng)的生物膜形成能力，并且該生物膜與其毒力有關(guān)[2]。隨著廣譜抗菌素大量使用，KP耐藥菌株不斷增加，嚴(yán)重威脅人類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[3]。KP不僅可以引起呼吸系統(tǒng)感染，還可導(dǎo)致各種外周組織感染，如手術(shù)感染、外傷及皮膚感染[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)KP引起的皮膚感染率比較高，Saaiq等報(bào)道巴基斯坦醫(yī)學(xué)院燒傷中心細(xì)菌感染病例中KP感染率為20.58%，位居第二[6]。前期通過收集臨床醫(yī)院的KP菌株，并進(jìn)行MLST分型，鑒定到該菌ST23型是宜昌地區(qū)的主要流行菌株[7]。為研究ST23菌株對皮膚的感染能力及其導(dǎo)致的皮膚膿腫過程中肥大細(xì)胞及其主要介質(zhì)的動態(tài)變化，為全面認(rèn)識本地區(qū)ST23型KP菌株導(dǎo)致的皮膚感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料濃度為 1×109cfu/100 μL或5×108cfu/50 μL的KP ST23型菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。甲苯胺藍(lán)購自Sigma公司；抗肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(Tryptase)一抗(ab2378)購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SPF級C57BL/6小鼠由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；MyD88KO小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所。

1.2 動物分組及感染實(shí)驗(yàn)將60只SPF級C57BL/6小鼠隨機(jī)分為 3組：PBS對照組(20只)、KP常規(guī)感染組(20只)和免疫抑制 KP感染組(20只)，20只MyD88KO小鼠接種KP作為免疫功能缺失感染組。所有C57BL/6和MyD88小鼠又分為兩個(gè)小組(10只/組)：其中一個(gè)小組用于接種后膿腫體積變化觀察，另一小組用于接種后1 d、5 d和10 d的皮膚采樣。免疫抑制KP感染組小鼠在KP感染前3 d按體質(zhì)量20 mg/kg連續(xù)注射環(huán)磷酰胺，然后再接種KP。所有小鼠均預(yù)飼養(yǎng)3 d后在其右側(cè)腹部皮下脫毛處理，再飼養(yǎng)5 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對照組小鼠皮下接種50 μL無菌PBS，而所有感染組小鼠均接種 50 μL KP 菌液(5×108cfu/小鼠)。接種后每天觀察小鼠兩次，主要觀察接種處皮膚變化，并做好記錄。實(shí)驗(yàn)過程中供給專用飼料及飲水，并遵循實(shí)驗(yàn)動物的 3R(Reduction、Replacement、Refinement、3R)原則給予人道關(guān)懷。

1.3 感染后小鼠皮膚膿腫的組織病理學(xué)變化對KP感染組和PBS對照組小鼠各隨機(jī)選取10只，觀察并記錄膿腫部位皮膚顏色變化、是否有潰瘍和結(jié)痂等狀況，并做好詳細(xì)記錄。每天兩次，分別用游標(biāo)卡尺測定膿腫的長徑與寬徑，按照公式[V=(π/6)L·W2]計(jì)算膿腫體積(L-膿腫長徑，W-膿腫寬徑)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

各組剩余10只小鼠在接種后1 d、5 d和 10 d時(shí)，分別隨機(jī)取3只小鼠斷頸迫殺，取膿腫處皮膚置于4%多聚甲醛溶液固定。常規(guī)包埋切片后進(jìn)行H.E染色，比較各組小鼠皮膚病理組織學(xué)變化。

1.4 感染后小鼠肥大細(xì)胞及其主要介質(zhì)的動態(tài)變化與觀察參照文獻(xiàn)[8]中改進(jìn)的甲苯胺藍(lán)染色方法，對上述皮膚組織制備5 μm鏡檢切片，顯微鏡下觀察不同組別小鼠肥大細(xì)胞的分布與形態(tài)，并分別計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞數(shù)量。

以抗肥大細(xì)胞 Tryptase抗體為一抗(1∶200)，羊抗鼠HRP-IgG為二抗(商業(yè)化Kit不需要稀釋，直接使用)，進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)。利用cellSens Entry圖像分析軟件采集照片，進(jìn)行IPP圖像分析。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，分析每個(gè)視野中Tryptase含量(面密度)，以Tryptase表達(dá)陽性區(qū)域占全視野面積的百分比表示，取其平均值，分別統(tǒng)計(jì)不同組別中Tryptase陽性物質(zhì)表達(dá)與分布變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，采用析因設(shè)計(jì)進(jìn)行方差分析，兩組數(shù)據(jù)之間的差異采用q檢驗(yàn)，p＜0.05為組間比較差異顯著，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 感染后小鼠皮膚膿腫體積變化所有接種KP的小鼠在感染第1 d時(shí)，皮膚出現(xiàn)紅腫，隨著感染時(shí)間延長，感染處膿腫也發(fā)生有規(guī)律的變化，在感染后5 d時(shí)，部分小鼠感染處皮膚開始出現(xiàn)潰瘍和破潰；到第10 d時(shí)，有些小鼠潰瘍處的皮膚開始結(jié)痂，呈現(xiàn)自動愈合過程。尤其是MyD88KO小鼠感染KP后有明顯的皮膚膿腫形成。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有感染KP小鼠的皮膚膿腫體積與PBS對照組相比差異極顯著(p＜0.001)，免疫抑制感染組小鼠皮膚膿腫體積和常規(guī)感染組相比差異顯著(p＜0.01)。所有KP感染組小鼠的皮膚膿腫體積均呈現(xiàn)動態(tài)變化規(guī)律，在感染早期呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，后期逐步降低(圖 1)，并且體積變化與膿腫的動態(tài)發(fā)展過程相一致。表明KP ST23型菌株能夠造成皮膚感染。

圖1 各組小鼠皮膚膿腫體積變化曲線Fig.1 The dynamics of skin abscess in KP-infected mice during the experimental period

2.2 感染后小鼠皮膚組織病理學(xué)變化分別于接種后1 d、5 d和10 d時(shí)觀察小鼠感染處皮膚組織，顯示在不同時(shí)間點(diǎn)PBS組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)均較完整，顯微鏡下無炎性細(xì)胞浸潤(圖2A、2E)；常規(guī)KP感染組小鼠有較明顯的皮膚組織病理變化，感染后1 d時(shí)皮下區(qū)域有明顯可見的炎性細(xì)胞分布，第5 d時(shí)皮膚纖維結(jié)構(gòu)破壞(圖 2B、2F)；免疫抑制組感染KP后皮膚炎癥反應(yīng)明顯(圖2D、2H)；MyD88KO組小鼠感染KP后第1d炎性細(xì)胞浸潤不明顯，第5 d時(shí)表皮細(xì)胞層遭到不同程度的破壞，結(jié)構(gòu)模糊不清，真皮乳頭層內(nèi)的皮脂腺結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，皮下組織炎癥區(qū)域大量炎癥細(xì)胞浸潤。真皮膠原結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，凝聚成片狀或條索狀，在其中有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖2C、2G)。表明本研究中的KP ST23型菌株能夠造成小鼠的皮膚炎癥，尤其是對環(huán)磷酰胺造成的免疫功能抑制小鼠及免疫功能缺陷的MyD88KO小鼠具有較強(qiáng)的皮膚損傷。

圖2 各組小鼠皮膚組織病理變化觀察(HE染色)Fig.2 Histopathologic examination of the skin in mice after infection with KP

2.3 感染后小鼠皮膚肥大細(xì)胞觀察采集各組小鼠皮膚組織，甲苯胺藍(lán)染色后觀察肥大細(xì)胞。結(jié)果顯示，對照組小鼠接種PBS后1 d與5 d時(shí)小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞很少且形態(tài)較小，并且主要分布在表皮層區(qū)域(圖3A、3 E)；常規(guī)感染組小鼠接種KP 1 d和5 d后皮膚表皮層與真皮層均可見肥大細(xì)胞分布(圖 3B、3F)；MyD88KO組小鼠接種KP 1 d和 5 d時(shí)可見其表皮層與真皮層均有大量肥大細(xì)胞分布(3C、3G)；免疫抑制組小鼠感染KP 1 d和5 d時(shí)可見大量的肥大細(xì)胞彌散分布表皮和真皮層(3D、3H)。對不同組感染 KP后 1 d、5 d和 10 d小鼠皮膚肥大細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示，與PBS對照組相比，KP各感染組小鼠肥大細(xì)胞數(shù)量均差異顯著(p＜0.001)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，除了PBS對照組，隨著感染時(shí)間延長，接種KP菌株的各組小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，但各感染組小鼠之間肥大細(xì)胞無顯著差異(3I)。接種KP后5 d時(shí)各組小鼠肥大細(xì)胞數(shù)目達(dá)到峰值，而后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，表明KP ST23型菌株能夠誘導(dǎo)小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞的活化。

2.4 感染后小鼠皮膚Tryptase的表達(dá)變化采集各組小鼠皮膚組織進(jìn)行免疫組化檢測其Tryptase的表達(dá)。結(jié)果顯示，PBS對照組小鼠皮膚中幾乎檢測不到tryptase(圖4A)，而各KP感染組小鼠皮膚組織中均能檢測到tryptase的表達(dá)與分布，尤其是炎癥區(qū)域中明顯可見，且在皮膚各層結(jié)構(gòu)中均檢測到tryptase陽性信號(圖4B～圖4D)。Tryptase陽性物質(zhì)面密度統(tǒng)計(jì)分析顯示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，各KP感染組小鼠皮膚中tryptase的表達(dá)均呈明顯增加趨勢，與 PBS對照組相比差異顯著(圖 4E，p＜0.001)，但其余感染組之間無顯著差異。各感染組小鼠在感染KP 5 d時(shí)tryptase的表達(dá)達(dá)到峰值，然后逐漸降低。表明KP感染后能夠誘導(dǎo)小鼠皮膚組織中Tryptase的活化，并且Tryptase的表達(dá)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

圖3 各組小鼠皮膚肥大細(xì)胞動態(tài)分布與數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.3 Dynamics of mast cells during the skin abscess in mice

圖4 Tryptase在各組小鼠皮膚中的表達(dá)分布與統(tǒng)計(jì)分析Fig.4 Expression and dynamics of tryptase in the skin abscess of mice

3 討論

KP可以通過皮膚接觸傳染，因此容易造成皮膚受傷后的術(shù)后感染或皮膚感染形成膿腫[4,6,9-10]。Guo等發(fā)現(xiàn)ST23型是溫州地區(qū)臨床KP的主要流行克隆[11]。Siu等通過收集臨床分離克雷伯菌株并經(jīng)MLST分型，顯示ST23型是香港、臺灣和新加坡等地區(qū)的主要流行株，進(jìn)一步研究顯示相對非ST23型菌株，ST23型菌株具有較強(qiáng)的抗吞噬效應(yīng)和對小鼠的致死能力[12]。本研究顯示ST23菌株能夠?qū)е滦∈笃つw膿腫形成，主要表現(xiàn)為小鼠表皮或真皮層有明顯可見的炎性細(xì)胞浸潤，正常結(jié)構(gòu)破壞。本研究結(jié)果表明本地區(qū)ST23型菌株具有較強(qiáng)的致病性。

MyD88是 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路中重要的接頭蛋白，van Lieshout和Cai等團(tuán)隊(duì)分別研究發(fā)現(xiàn)MyD88對宿主抗克雷伯菌感染至關(guān)重要[13-14]，MyD88KO小鼠感染克雷伯菌后易死亡，且機(jī)體清除細(xì)菌的能力顯著降低。Feuerstein等發(fā)現(xiàn)真皮層巨噬細(xì)胞MyD88分子在宿主抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)過程中能快速傳遞信號[15]。本研究顯示相較于正常C57BL/6小鼠，MyD88KO小鼠感染KP后形成膿腫的體積較大，皮膚膿腫自愈時(shí)間較晚，并且該表型小鼠與用環(huán)磷酰胺預(yù)處理的小鼠類似。

肥大細(xì)胞廣泛分布于皮膚、呼吸道等組織中，在抗皮膚感染等中發(fā)揮重要作用[16]，但KP皮膚感染及膿腫形成過程中肥大細(xì)胞動態(tài)變化的研究少有報(bào)道。本研究中與PBS對照組相比，各KP感染組小鼠中肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且部分表現(xiàn)為脫顆粒狀態(tài)，提示肥大細(xì)胞在KP介導(dǎo)膿腫形成過程中激活并釋放介質(zhì)參與發(fā)病進(jìn)程。但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在各KP感染組小鼠之間肥大細(xì)胞數(shù)目與Tryptase表達(dá)無明顯差異，表明ST23型菌株對免疫抑制或免疫缺陷動物造成的皮膚損傷效應(yīng)可能還依賴于其它通路或關(guān)鍵分子。

Tryptase為肥大細(xì)胞激活的標(biāo)志[8,17]，本研究結(jié)合免疫組化染色與圖像分析技術(shù)，比較了Tryptase在PBS對照組與各KP感染組中的表達(dá)與變化趨勢，結(jié)果顯示在KP感染早期，Tryptase表達(dá)逐漸增加，在第感染KP第5 d時(shí)表達(dá)量最高，然后逐漸降低，其表達(dá)量與肥大細(xì)胞變化趨勢相一致，表明KP感染后能夠誘導(dǎo)Tryptase表達(dá)。Lei等通過ST239型MRSA菌株建立小鼠皮膚感染模型，結(jié)果顯示隨著感染時(shí)間延長，小鼠感染處皮膚組織有明顯活化的肥大細(xì)胞并能釋放 Tryptase[16]。Hodille等通過細(xì)胞模型研究MRSA誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活性時(shí)，顯示MRSA菌株的delta-溶血素(Hld)和酚可溶性調(diào)節(jié)肽 (Phenol soluble modulins，PSMs)等可通過劑量依賴方式誘導(dǎo)HMC-1人肥大細(xì)胞釋放類蛋白酶[18]。本實(shí)驗(yàn)再次印證了以上研究結(jié)果。表明ST23型KP菌株能夠誘導(dǎo)小鼠皮膚組織釋放Tryptase參與到皮膚炎癥反應(yīng)和組織損傷過程，但其具體機(jī)制還有待深入研究。

本研究利用ST23型KP流行株皮下接種SPF級C57BL/6小鼠，對皮膚膿腫形成過程進(jìn)行了時(shí)相性觀察，記錄其皮膚膿腫體積變化，并進(jìn)一步比較了其皮膚組織病理學(xué)變化。本研究結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性好、為進(jìn)一步研究KP臨床分離株的病原特性、致病機(jī)制等小動物感染模型提供依據(jù)。另外由于ST23型KP是在宜昌地區(qū)首次分離鑒定，提示該型細(xì)菌在該地區(qū)具有重要臨床意義。