宋雨心，王文騫，張 園，劉琳琳，王婷婷，祁小樂，高玉龍，王永強(qiáng)，高宏雷，李 凱，劉長軍，張艷萍，高 立，王笑梅*，崔紅玉*，何高明

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽免疫抑制病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱150069)

益生菌廣泛分布于自然界中，被定義為“足夠量可給予機(jī)體健康益處的微生物”(FAO/WHO，2009)，它們大多是可利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸、安全無毒、無致病性、無致癌性的一類革蘭氏陽性細(xì)菌，在世界范圍內(nèi)被公認(rèn)為“GRAS”級(食品安全級)的微生物[1-2]。益生乳酸菌能夠促進(jìn)腸道微生物群落的生態(tài)平衡、控制內(nèi)毒素、抑制腸道病原體如大腸桿菌、沙門氏菌等；調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，影響宿主健康等[3-4]。李平蘭等的研究表明，來自豬和人類糞便的不同種類乳酸菌在體外與人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞的黏附能力不同，而HT-29細(xì)胞在體外易培養(yǎng)，其形態(tài)、黏附能力等與腸上皮細(xì)胞類似，能表達(dá)正常人腸細(xì)胞的形態(tài)和某些生理特性，所以常被用于黏附實(shí)驗(yàn)[5]。黏附是指細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞通過生物化學(xué)作用產(chǎn)生的特異性粘連。乳酸菌對腸道上皮細(xì)胞的黏附作用有助于其在腸道定植、增強(qiáng)乳酸菌與腸道細(xì)胞之間的信號交流和提高機(jī)體的免疫力，因此乳酸菌的黏附特性是評價其是否具有良好調(diào)節(jié)免疫功能的重要指標(biāo)，是影響活菌制劑效果的關(guān)鍵因素之一[6-7]。目前抗生素被廣泛用于飼料添加劑來預(yù)防疾病，促進(jìn)動物機(jī)體生長，降低其死亡率。但隨著抗生素的濫用造成的細(xì)菌耐藥性、藥物殘留等問題日益突出，嚴(yán)重危害人類健康。因此，尋找能代替抗生素的天然物質(zhì)刻不容緩，有研究者指出，益生菌可作為最佳的替代品之一，具有增強(qiáng)宿主抵抗力、提高機(jī)體健康水平、減少疾病發(fā)生等優(yōu)點(diǎn)[2]。

本研究以10株乳桿菌為研究對象，研究了乳桿菌黏附腸道細(xì)胞與抗腸道腫瘤增殖及抗腸道致病菌的作用，篩選出具有強(qiáng)黏附特性及抗腸道腫瘤、抗腸道致病菌的乳桿菌，為活菌制劑的選擇、抗腫瘤制劑及替代抗生素制劑等的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞10株乳桿菌(表1)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所益生菌種資源庫-80℃保存，均為天然健康(非人工飼養(yǎng))動物腸道中分離，經(jīng)過耐酸(pH3.0)、耐膽鹽(0.3%)實(shí)驗(yàn)篩選和動物飼喂實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的益生菌株。標(biāo)準(zhǔn)致病菌株大腸埃希氏菌ATCC25922(Escherichia coliATCC25922)、雞白痢沙門氏菌 CVCC578(Salmonella pullorumCVCC578)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 25923)均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系(HT-29細(xì)胞)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存。

表1 10株候選乳桿菌菌株Table 1 10 strains of candidate Lactobacillus

1.2 主要試劑MRS培養(yǎng)基購自青島海博生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；100×青-鏈霉素、0.25%胰酶-EDTA、磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)、臺盼藍(lán)、4%多聚甲醛購自Life Technologies公司；TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；4',6-二脒基 -2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、羧基熒光素雙乙酸鹽-琥珀酰亞胺酯(carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)購自Sigma公司。

1.3 乳桿菌的培養(yǎng)及菌懸液的制備乳桿菌菌種按1%體積接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18 h后傳代，傳代培養(yǎng)3次后備用；標(biāo)準(zhǔn)致病菌按1%接種于LB液體培養(yǎng)基，于37℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng)18 h備用；離心收集菌體(5 000 r/min，4℃，10 min)，PBS洗滌3次，將菌體用PBS重懸，調(diào)整細(xì)菌懸液的 OD600nm值至 1±0.05(約為 2×108cfu/mL)備用。

1.4 乳桿菌自聚集能力測試根據(jù)Polak-Berecka[8]等和Kos[9]等文獻(xiàn)進(jìn)行自聚集測定：取5 mL 1.3所獲得的細(xì)菌懸浮液渦旋10 s，并在37℃下靜止孵育2 h，測量上清液的OD600nm值。根據(jù)下列公式1計(jì)算細(xì)菌的自聚集率(Ac%)：

公式 1： AC(%)=[1-(A2h/A0)]×100

其中，A0是細(xì)菌懸浮液渦旋后測定的初始OD600nm值；A2h是靜止孵育2 h后細(xì)菌懸液上清的OD600nm值。

1.5 乳桿菌與致病性細(xì)菌的共聚集能力測試根據(jù)Xu[10]等文獻(xiàn)進(jìn)行共聚集測定：乳桿菌、標(biāo)準(zhǔn)致病菌菌懸液各取2 mL(2×108cfu/mL)等體積混合，渦旋10 s，并在37℃下靜止孵育2 h，每個離心管總體積為4 mL。2 h后測定上清液OD600nm值，并根據(jù)公式2計(jì)算共聚集率(Cc%)：

公式 2：CC(%)=[1-COmix/(COstrain+COpathogen)/2]×100

其中，COmix是混合物培養(yǎng) 2 h后的 OD600nm值，COstrain是乳桿菌的初始光密度OD600nm值，COpathogen是標(biāo)準(zhǔn)致病菌的初始OD600nm值。

1.6 乳桿菌黏附能力的測定HT-29細(xì)胞2 d更換一次培養(yǎng)液，3 d進(jìn)行傳代，傳代5次后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù) Zhang[11]等、Duary[12]等和劉東方[6]等的方法進(jìn)行了改進(jìn)：將 HT-29細(xì)胞以 2×105個 /孔的密度分別接種于6孔板、12孔板中，隔天更換培養(yǎng)液，待其生長至70%～80%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用PBS(pH7.4)清洗6孔板中的細(xì)胞兩次。取1 mL乳桿菌菌懸液(OD600nm=1.0，2×108cfu/mL)經(jīng) 4 000 r/min，離心10 min，用無菌PBS清洗3次后加入1 mL 50 μmol/L的羧基熒光素雙乙酸鹽-琥珀酰亞胺酯(Carboxy-fluorescein diacetate， succinimidyl ester， CFSE)溶 液 ，于37℃搖床避光培養(yǎng)20 min將細(xì)菌著色，隨后4 000 r/min，離心10 min收集菌體，用無菌的PBS清洗3次后使用2 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸菌體。每孔加入1 mL菌懸液，將6孔板于37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h。將所有孔用無菌PBS洗滌4次，并用4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗后，加入0.1%Triton X-100，靜置10 min。最后，使用DAPI染細(xì)胞核，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 乳桿菌內(nèi)化能力的測定根據(jù)Cirillo[13]等方法進(jìn)行改進(jìn)：用PBS清洗接種于12孔板且生長至70%～80%的HT-29細(xì)胞兩次，取1 mL乳酸菌懸液(OD600nm=1.0，2×108cfu/mL)，每孔按 MOI為 1 000∶1(細(xì)菌與細(xì)胞數(shù)量的比值)加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃，5%CO2共培養(yǎng) 2 h。PBS洗滌細(xì)胞 3～4次，除去未黏附的細(xì)菌，加入150 μg/mL慶大霉素作用 1 h，每孔加入 0.25%胰酶靜置 3 min，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)。然后加入0.5%Triton-X100，靜置5 min。最后將混合物經(jīng)一系列10倍連續(xù)稀釋，接種于固體MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h～48 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算內(nèi)化率：

1.8 乳桿菌抗HT-29細(xì)胞增殖能力的檢測根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]，以CCK8試劑盒測定乳桿菌對人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的抗增殖作用。將濃度為2×104個/100 μL的HT-29細(xì)胞接種于96孔板中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌細(xì)胞2次，每個孔按MOI為100∶1加入OD600nm為1.0的乳酸菌懸液，于37℃5%CO2培養(yǎng)16 h后臺盼藍(lán)法檢查細(xì)胞活力，每孔加入10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)4 h后測定OD450nm。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖百分比：

細(xì)胞增殖(%)=[(Ates-Acontrol)/Acontrol]×100

其中Atest為與乳桿菌相互作用的HT-29細(xì)胞孔的 OD450nm；Acontrol為僅 HT-29細(xì)胞孔的 OD450nm。

1.9 乳桿菌的體外抗菌活性乳桿菌按1%體積接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，作為待測菌液。將培養(yǎng)18 h的指示菌按0.2%接種于約50℃熔化的LB瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻，倒入預(yù)先放有牛津杯的培養(yǎng)皿中待其凝固后，取出牛津杯，在每個牛津杯孔中加入200 μL待測乳桿菌培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)大小。

2 結(jié)果

2.1 乳桿菌自聚集能力檢測結(jié)果對10種乳桿菌進(jìn)行自聚集能力檢測，結(jié)果顯示，Lac.97菌株具有最強(qiáng)的自聚合能力，達(dá)到67.73%，顯著高于其它菌株(p＜0.0001)，其次是 Lac.95、Lac.71、和 Lac.99菌，自聚合能力分別為41.84%、32.48%和26.93%。候選菌株 Lac.95、Lac.97、Lac.99、Lac.56、Lac.71、Lac.85等6株乳桿菌的自聚合能力均達(dá)到20%以上(圖 1)。

圖1 10株乳桿菌自聚集能力分析Fig.1 Analysis of auto-aggregation ability of the 10 strains Lactobacillus

2.2 乳桿菌與致病菌的共聚集能力檢測結(jié)果10株候選菌株與致病菌共聚合能力測試，結(jié)果顯示10株乳桿菌與致病性大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的共聚集能力均較強(qiáng)，均達(dá)到80%以上(圖2)。表明本試驗(yàn)中的10株乳桿菌均可共聚集致病菌。

圖2 10株乳桿菌與致病菌的共聚集能力比較Fig.2 Comparison of co-aggregation ability between 10 Lactobacillus strains with the pathogenic bacteria

2.3 乳桿菌體外黏附上皮細(xì)胞的觀察將HT-29細(xì)胞與CFSE染色的各乳桿菌菌懸液共培養(yǎng)，于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，Lac.99菌株黏附能力最強(qiáng)，其余乳桿菌株對上皮細(xì)胞也具有強(qiáng)度不一的黏附性(圖 3)。表明10株乳桿菌對HT-29細(xì)胞均具有黏附能力。

2.4 乳桿菌內(nèi)化腸道上皮細(xì)胞結(jié)果根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，菌株Lac.86、Lac.87、Lac.99、Lac.85等4株乳桿菌對HT-29的內(nèi)化率達(dá)到5%以上，其中Lac.99菌株內(nèi)化率最高，達(dá)到14.85%，顯著高于除Lac.87外的菌株(p＜0.0001)(圖 4)。表明篩選到的Lac.86、Lac.87、Lac.99、Lac.85乳桿菌均具有對腸道上皮細(xì)胞較強(qiáng)的內(nèi)化作用。

圖3 乳桿菌Lac.99黏附及內(nèi)化HT-29細(xì)胞Fig.3 Observation of Lactobacillus strain lac.99 adhesion and internalization HT-29 cells

圖4 10株乳桿菌的內(nèi)化能力Fig.4 Analysis of the internalization ability of the 10 Lactobacillus stains

2.5 乳桿菌抗人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞增殖能力的檢測結(jié)果體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，在10種乳桿菌中，Lac.117、Lac.56菌株具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞HT-29增殖的作用，其中作用最強(qiáng)的是Lac.56菌株，達(dá)到49.71%，與 Lac.117相比差異顯著(p＜0.05)，而其余乳桿菌菌株對HT-29細(xì)胞的增殖影響不明顯，差異不顯著(圖 5)。表明篩選到的乳桿菌株 Lac.117，Lac.56具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。

圖5 10株乳桿菌對HT-29細(xì)胞的抗增殖能力Fig.5 The anti-proliferation ability of 10 Lactobacillus strains against HT-29 cells

2.6 乳桿菌體外抑菌活性檢測結(jié)果采用抑菌環(huán)試驗(yàn)檢測篩選的乳桿菌體外抑菌活性，結(jié)果顯示，10株乳桿菌對致病性大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其中Lac.117菌株對3種致病菌的抑制作用均最強(qiáng)，抑菌環(huán)直徑分別為16 mm、17 mm和 15 mm(表 2)。表明本研究篩選的乳桿菌均具有不等的抑菌活性。

表2 乳桿菌對致病菌的抑制活性Table 2 Inhibition activity of Lactobacillus against pathogenic bacteria

3 討論

據(jù)報(bào)道乳酸菌自聚集能力與其黏附能力密切相關(guān)，研究表明自聚集能力強(qiáng)的乳酸菌往往具有較強(qiáng)的黏附腸道上皮細(xì)胞的能力，因此測定乳酸菌自聚集能力是篩選其黏附特性的首要指標(biāo)[16]。只有當(dāng)乳酸菌黏附于腸上皮細(xì)胞表面時，才能定植于腸道上皮細(xì)胞表面，有效發(fā)揮其抑制致病菌侵襲腸粘膜的生物屏障的功能[17]。腸道黏膜上皮細(xì)胞中、黏膜固有層以及派伊爾氏結(jié)(PP)中分布有許多免疫活性細(xì)胞，部分分布在上皮之間，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，細(xì)菌的黏附和內(nèi)化與這些黏膜免疫細(xì)胞密切相關(guān)，乳桿菌的內(nèi)化是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用或運(yùn)載特定抗原到達(dá)效應(yīng)部位的前提[18-21]。

本研究通過體外腸道上皮細(xì)胞模型測試了10株乳桿菌的黏附能力及其抗腫瘤、抗致病菌能力。結(jié)果顯示，10株乳桿菌中，60%的乳桿菌自聚集能力達(dá)到20%以上。其中l(wèi)ac.97菌株自聚集能力最強(qiáng)達(dá)到67.73%，高于Abbasiliasi[16]等報(bào)道的乳桿菌自聚集能力(35.2%)，表明lac.97乳酸菌具有高黏附特性，高黏附特性益生菌的獲得為將來益生菌的抗菌活性研究，以及乳桿菌免疫調(diào)節(jié)劑的研究奠定重要的基礎(chǔ)。通過顯微鏡下觀察10株乳桿菌對腸道HT-29細(xì)胞不僅具有黏附性而且可通過細(xì)胞膜內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。lac.97菌株自聚集能力強(qiáng)但內(nèi)化能力較弱，而lac.117菌自聚合能力與lac.97菌相比較低，但lac.117內(nèi)化能力很強(qiáng)，表明自聚集能力與黏附和內(nèi)化能力不一定成正相關(guān)。經(jīng)平板計(jì)數(shù)測定Lac.117內(nèi)化率，可達(dá)到14.85%，與顯微鏡觀察到的結(jié)果一致，lac.117的內(nèi)化率較Cirillo[13]等報(bào)道的乳桿菌的內(nèi)化率更高，提示lac.117可能具有更強(qiáng)的抗原遞送潛力。

此外，本研究通過抑制腫瘤細(xì)胞生長和細(xì)胞活力來驗(yàn)證乳桿菌的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示lac.117和lac.56乳桿菌對人結(jié)直腸腺癌HT-29細(xì)胞的生長均具有較強(qiáng)的抑制作用，其抗增殖能力分別達(dá)到27.15%和49.71%，該結(jié)果與Grimoud J[15]描述的一致且抑制能力更強(qiáng)。研究報(bào)道乳酸菌抑制病原菌的能力和其與病原菌共聚集能力有關(guān)，本研究顯示10株乳桿菌與病原細(xì)菌的的共聚集能力相當(dāng)[9-10]，差異不顯著，但體外抑菌試驗(yàn)表明lac.117對致病菌大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)。通過比較分析10株乳桿菌的黏附特性、抗致病菌特性和抗腫瘤細(xì)胞增殖特性，顯示這些菌株不能同時在所有益生特性指標(biāo)上表現(xiàn)優(yōu)秀，即不同乳桿菌的益生特性千差萬別，一株益生菌不能同時具有各種益生特性，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[22]，可能這與它原本的生活環(huán)境、產(chǎn)生不同的副產(chǎn)物、生物特性以及其他因素等有關(guān)，但綜合以上結(jié)果可見Lac.56各方面特性均較好。