蔡川黃也王婧薛芃徐娟張彤徐璐璐

牙周膜干細胞(PDLSCs)具有自我更新及多向分化能力，是牙周組織再生的理想種子細胞之一[1]。牙周炎是一種由牙周致病菌引發(fā)的影響牙齒支持組織的炎癥性疾病。牙周炎狀態(tài)下PDLSCs的生物學功能受到損害，導致牙周組織再生修復能力下降[2]，因此，探索牙周炎癥微環(huán)境導致PDLSCs生物學功能受損機制、促進PDLSCs的牙周再生能力是學者們關注的熱點。

近年來，很多學者發(fā)現(xiàn)牙周炎和許多全身性疾病有顯著關聯(lián)性，并且提出了這些疾病的共同發(fā)病機制——氧化應激[3,4]。氧化應激是指機體在受到各種有害刺激時，體內活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)產生過多，從而導致組織損傷。線粒體是細胞能量代謝的場所，其氧化磷酸化作用是細胞內ROS的主要來源。線粒體ROS可以通過改變氧化還原反應的狀態(tài)來起介導信號調節(jié)的作用，從而決定干細胞的自我更新和分化[5]。

腫瘤壞死因子 -α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在牙周炎發(fā)病中起重要作用。TNF-α促進中性粒細胞和單核細胞更易于粘附至血管壁，并通過趨化作用移行至炎性組織內，導致更多炎性介質產生。同時，TNF-α能夠刺激成纖維細胞膠原酶的產生，造成牙周組織損害[6]。

目前關于PDLSCs在炎癥微環(huán)境下的氧化應激狀態(tài)及其機制的研究尚未見報道。本研究培養(yǎng)了正常及慢性牙周炎來源的PDLSCs，研究了炎癥微環(huán)境對PDLSCs氧化應激及線粒體生成的影響，以期更好地調控細胞特性，抵抗氧化應激，從而有益于牙周組織再生。

1.材料和方法

1.1 材料 胎牛血清，α-MEM培養(yǎng)基，Ⅰ型膠原，0.25%胰蛋白酶，青鏈霉素(美國Gibco)，TNF-α(美國 Peprotech)，MitoSOX Red 線粒體ROS檢測試劑盒(mp36008，美國 Invitrogen)，DCFH-DA(二氯熒光黃雙乙酸鹽)ROS檢測試劑盒(mp36013，美國Invitrogen)，實時定量PCR儀Applied Biosystems 7500(美國)，RNA抽提試劑盒及逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen)，Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物(上海生物工程公司)，Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒(大連寶生物)，Western及IP裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天)，ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2、SOD2(美國Abcam)，GAPDH 抗體，羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。

1.2 樣本收集與細胞分離培養(yǎng) 經解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情并簽署同意書后，獲得因正畸需要拔除的健康牙以及因慢性牙周炎二型骨吸收拔除的患牙。患者年齡32～40歲，男女各半，其中收集健康離體牙樣本6顆，慢性牙周炎離體牙樣本8顆。所有納入個體均無系統(tǒng)性疾病及已知可以影響牙周狀況的疾病，無吸煙史，近6個月無特殊服藥史。牙齒拔除后立即放入含雙抗的α-MEM中。使用含雙抗的PBS反復沖洗，刮取根中下1/3牙周膜，采用組織塊+膠原酶法培養(yǎng)原代細胞，培養(yǎng)約3～7d后細胞從組織中爬出，達到80%匯合度時用胰酶消化傳代。采用有限稀釋法培養(yǎng)PDLSCs，消化收集第一代細胞，調整細胞密度為10個/mL，將細胞懸液加入96孔板，使每孔細胞懸液中約有1個細胞。24 h后在倒置顯微鏡下觀察，挑選單細胞貼壁孔，待孔中細胞形成較大克隆，合并多個單克隆來源的細胞懸液，體外擴大培養(yǎng)。采用第3～4代多克隆PDLSCs用于實驗研究。參照以往研究進行H-PDLSCs和P-PDLSCs的干細胞標志物與生物學特性檢測[7]。實驗分組為健康牙周膜干細胞(H-PDLSCs)組、炎癥牙周膜干細胞(P-PDLSCs)組和TNF-α(作用時間7d，濃度參考以往研究選用10ng/mL[8])作用于健康牙周膜干細胞(T-PDLSCs)組。

1.3 熒光探針檢測線粒體和全細胞ROS水平以無血清培養(yǎng)液分別稀釋MitoSOX和DCFH-DA(1∶1000)，使終濃度為 5μmol/L 和 10μmol/L，加入培養(yǎng)各組細胞的96孔板中，每孔加入200μL。37℃避光孵育30min，PBS洗滌2次后，用DAPI標記細胞核后孵育10min，再次洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察。細胞MitoSOX熒光強度激發(fā)波長510nm，發(fā)射波長580nm，DCFH-DA激發(fā)波長495nm，發(fā)射波長525nm。利用Image pro plus圖像分析軟件測量細胞灰度，每個樣品檢測30個細胞，所有樣品拍攝條件固定。

1.4 實時定量PCR檢測 用Trizol裂解細胞并提取總RNA，測定RNA濃度，分別反轉錄為cDNA，利用Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒進行熒光定量PCR檢測，反應體系均為20μl。反應條件：變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環(huán)。引物通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/網站的Primer-BLAST設計。引物序列與Refseq ID如下：

ERRα(NM_004451)：Forward：5’-AGGGTTCCTCGGAGACAGAG-3’，Reverse： 5’-TCACAGGATGCCACACCATAG-3’；PGC-1α(NM_01326)：Forward：5’-TCTGAGTCTGTATGGAGTGACAT-3’，Reverse：5’-CCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA-3’； PGC-1β (NM_133263)：Forward：5’-GATGCCAGCGACTTTGACTC-3’，Reverse：5’-ACCCACGTCATCTTCAGGGA-3’；TIMM13(NM_012458)：Forward：5’-CAGAGGATGACGGACAAGTGT-3’，Reverse： 5’-CATGTAGCGGTCCATGCACA-3’；MFN2(NM_014874)：Forward：5’-CTCTCGATGCAACTCTATCGTC-3’，Reverse：5’-TCCTGTACGTGTCTTCAAGGAA-3’；SOD2(NM_001322820)：Forward：5’-GCTCCGGTTTTGGGGTATCTG-3’，Reverse：5’-GCGTTGATGTGAGGTTCCAG-3’； PRDX3(NM_001302272)：Forward：5’-ACAGCCGTTGTCAATGGAGAG-3’，Reverse：5’-ACGTCGTGAAATTCGTTAGCTT-3’；GAPDH(NM_001289746)：Forward：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，Reverse：5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。

1.5 Western blot檢測 采用細胞裂解液試劑盒提取各種細胞膜中的總蛋白，BCA法測定蛋白樣本濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，將凝膠中的蛋白在轉移電泳槽中轉至PVDF膜。用TBST緩沖液配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液對PVDF膜封閉2h，PVDF膜封閉ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2、SOD2 抗體(1∶ 1000)稀釋，4℃過夜。洗膜3次后加入相應濃度的二抗，室溫條件下封閉2h，洗膜3次。在Bio-Rad凝膠成像儀中獲取蛋白條帶圖像，圖像分析軟件分析各樣品目的條帶的灰度值。

1.6 流式細胞術 消化收集各組細胞，分別以MitoSOX和DCFH-DA孵育，調節(jié)細胞密度為5×106/mL，每個樣品采集10000個細胞。使用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.7 統(tǒng)計學分析 每個實驗組設置3個平等樣本，每個樣本重復檢測3次取均值。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 炎癥微環(huán)境提高PDLSCs線粒體和全細胞ROS水平 正常及炎癥牙周膜組織來源的PDLSCs在原代與有限稀釋法克隆培養(yǎng)后，分為三組(H-PDLSCs組，P-PDLSCs組，T-PDLSCs組)培養(yǎng)7d。光學顯微鏡下觀察三組細胞形態(tài)無明顯差異，均呈梭形、貼壁生長(圖1)。

圖1 H-PDLSCs，P-PDLSCs和T-PDLSCs細胞培養(yǎng)(第4代細胞，培養(yǎng)3天，圖中標尺=50μm)

熒光顯微鏡觀察和流式細胞術檢測熒光染色水平，其中MitoSOX熒光強度結果反映線粒體ROS水平(圖2)，DCFH-DA熒光強度反映全細胞 ROS水平(圖 3)。H-PDSLCs組細胞MitoSOX和DCFH-DA熒光顯色區(qū)域均局限于細胞核周圍(圖2A，圖3A)而P-PDLSCs組合T-PDLSCs組兩種熒光強度和范圍都明顯增大。兩組細胞的流式細胞術檢測結果相似(圖2B，圖3B)：與H-PDLSCs相比，P-PDLSCs和T-PDLSCs組的ROS水平均有顯著升高。T-PDLSCs組升高程度不及P-PDLSCs組，但不具有統(tǒng)計學意義。結果表明，炎癥微環(huán)境促進了線粒體ROS水平的提高，進而促進了全細胞ROS水平的提高。

2.2 炎癥微環(huán)境降低PDLSCs線粒體生成與抗氧化水平 實時定量PCR結果顯示(圖4)：ERRα、PGC-1α、PGC-1β、TIMM13、MFN2、SOD2 和PRDX3的mRNA表達水平在P-PDLSCs中均有顯著降低，ERRα、PGC-1α、TIMM13、MFN2、SOD2和PRDX3的mRNA表達水平在T-PDLSCs中也有顯著降低。Western blot結果顯示(圖5)：ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2 和 SOD2 蛋白表達水平在P-PDLSCs組中顯著下調，而在T-PDLSCs組中各蛋白表達也有所下調，僅MFN2蛋白水平與H-PDLSCs組相比沒有統(tǒng)計學意義。

圖2 MitoSOX檢測線粒體ROS水平

圖3 DCFH-DA檢測全細胞ROS水平

圖4 實時定量PCR檢測三組細胞線粒體生成相關基因ERRα、PGC-1α、PGC-1β、TIMM13、MFN2和抗氧化基因SOD2和PRDX3的mRNA表達情況(**P＜ 0.01，*P＜ 0.05 vs.H-PDLSCs)

圖5 Western blot檢測三組細胞ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2、SOD2蛋白表達情況(**P＜ 0.01，*P＜ 0.05 vs.H-PDLSCs)

3.討論

影響PDLSCs生物學特性的因素很多[9]，炎癥是最常見的影響干細胞微環(huán)境的體內因素之一。研究表明，患有牙周炎的PDLSCs經體外分離培養(yǎng)后仍具有一定的炎癥特性[2]，這有助于研究炎癥微環(huán)境對PDLSCs生物學功能的損害。牙周炎被認為是菌斑刺激下局部牙周組織產生的過度免疫反應，其中菌斑最主要的產物脂多糖可刺激宿主細胞產生炎性因子，如TNF-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6等。鑒于TNF-α在牙周炎發(fā)病中的重要作用，本實驗設置了TNF-α單獨處理組，結果證實該因子對健康PDLSCs生物學功能的損害與炎癥來源的PDLSCs效應相似。

近年研究認為，氧化應激的直接和間接參與是導致牙周組織破壞的關鍵因素，牙周炎不僅是氧化應激相關的全身疾病的局部表現(xiàn)，也可以通過氧化應激來促進這些疾病的進展[10,11]。氧化應激是因ROS生成過多，破壞了與抗氧化機制間的平衡，從而導致潛在病例損傷的過程。生理水平的ROS參與調控細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、信號轉導、凋亡等生理活動，而過量ROS則產生細胞毒性，對蛋白質、脂質、DNA造成氧化損傷，干擾細胞生長和細胞周期進程，并誘導細胞凋亡。ROS還能通過激活炎性因子、核因子κB(NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(JNKs)及自噬改變牙周微環(huán)境而對牙周組織造成間接的嚴重破壞[12]。牙周炎的始動因素是細菌，而細菌對宿主的侵襲導致了ROS的產生。研究表明，干細胞的功能與線粒體和ROS有重要聯(lián)系，例如間充質干成骨分化過程中，線粒體生物合成增加、氧化作用增強，同步伴隨著抗氧化能力的提高[13]。因此，本研究檢測了炎癥微環(huán)境以及炎癥因子TNF-α的作用對PDLSCs氧化應激的影響，發(fā)現(xiàn)兩種條件確實顯著提高了PDLSCs的ROS水平。我們選擇了兩種熒光探針MitoSOX和DCFH-DA分別檢測線粒體和全細胞ROS水平。兩種檢測結果的相似性證實線粒體是正常狀態(tài)下細胞ROS生成的主要場所，而炎癥微環(huán)境主要通過提高線粒體ROS水平提高了全細胞的ROS水平。

為探索炎癥微環(huán)境促進氧化應激的機制，我們進一步對線粒體合成及抗氧化相關基因表達水平進行了檢測。雌激素相關受體(estrogen-related receptor，ERR)α屬于核受體超家族中孤兒核受體家族的一員，其弱轉錄活性可被過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活因子 1α/β(PGC-1α/β)激活放大從而調控下游基因轉錄，在線粒體生物合成和能量代謝中起關鍵作用[14]。線粒體融合蛋白(mitofusin，MFN)2是線粒體外膜上的跨膜蛋白，介導線粒體融合[15]；線粒體內膜轉運酶(translocase of inner mitochondrial membrane,TIMM)13是線粒體內膜的標記蛋白，這些蛋白表達水平的高低可在一定程度上說明線粒體的數(shù)量水平。本研究發(fā)現(xiàn)ERRα、PGC-1α/β、MFN2、TIMM13在炎癥來源PDLSCs和TNF-α作用下的健康PDLSCs中均被下調，表明細胞線粒體生物合成功能受到影響，并推測可能會進一步影響細胞增殖、凋亡與自噬，但尚需進一步實驗證實。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)2和硫氧還蛋白依賴的過氧化物還原酶(Peroxiredoxin-3,PRDX3)分布于線粒體內，能夠清除呼吸鏈相關反應產生的O2-，并參與細胞增殖、分化與凋亡[16,17]。本研究中，P-PDLSCs與T-PDLSCs的SOD2和PRDX3表達顯著降低，提示炎癥微環(huán)境損害了線粒體內源性抗氧化防御機制。

綜上所述，本研究表明，牙周炎癥微環(huán)境提高了PDLSCs的ROS水平，影響了線粒體發(fā)生與抗氧化防御系統(tǒng)，從而對PDLSCs生物學功能造成損害。其進一步機制有待后續(xù)研究闡明，以求為基于PDLSCs的牙周組織再生治療提供新的理論依據(jù)。