李影 劉娜 張維 顧斌

牙周炎是發(fā)生于牙周支持組織的慢性破壞性疾病。全國第三次流行病調查結果顯示80%人口均患有牙周炎[1]。牙周炎的現有治療手段主要是牙周基礎治療配合局部抗炎藥物的使用，并不能夠有效的治愈牙周炎。PDLSCs是從牙根分離出的多向分化能力的干細胞，可以修復牙周組織的破壞及損傷，但是在慢性炎癥微環(huán)境下，PDLSCs的成骨分化能力及修復牙周組織能力減弱。牙周組織破壞的機制是怎樣的呢？

金巖課題組發(fā)現TNFα通過激動Wnt通路來抑制PDLSCs的成骨能力，DKK-1抑制Wnt通路后可部分恢復PDLSCs的成骨能力。而骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)通過激活Wnt3a來增加成骨能力[2]。本課題組前期研究表明，在干細胞增殖及成骨分化過程中經典Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮關鍵作用，過表達β-catenin可增強PDLSCs的增殖能力，抑制PDLSCs的成骨分化能力[3]。后又對炎癥微環(huán)境下的PDLSCs成骨分化機制進行探究，結果顯示在慢性炎癥微環(huán)境中非經典Wnt信號通路參與PDLSCs的成骨分化，Wnt/Ca2+通路中CaMKII、NLK蛋白與干細胞成骨分化正相關[4]。徐雅麗等對門診拔除的25顆慢性根尖周炎患牙研究表明，與對照組相比，慢性根尖周炎中根尖周病變組織檢測出Wnt5a量相對較高。并且表達的高低與根尖周病變范圍的大小有相關性。推測Wnt5a在慢性根尖周炎的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用[5]。那么在慢性牙周炎中，Wnt5a是否也起著一定的作用呢。本研究將探究在慢性炎癥微環(huán)境下，Wnt5a在PDLSCs中的作用及其機制。

1.材料與方法

1.1 材料 α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)(Gibco BRL)；PBS、loading buffer、彩虹 180 廣譜蛋白marker、甘氨酸電泳緩沖液、電泳轉移緩沖液、5%BSA封閉液、ECL超敏發(fā)光液(Solarbio)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Sigma,St Louis,MO,美國)；EDTA;青鏈霉素(Gibco BRL)；實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國 Life Technologies公司)；RNA抽提試劑盒及逆轉錄試劑盒(Takara，日本)；4%組織細胞固定液(Solarbio)；RIPA(Invitrogen)；引物(華大基因)；Wnt5a抗體，羊抗兔免疫熒光二抗(Abcam)；丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(AP)、Bis-Tris、十二烷基硫酸鈉鹽(SDS)(Sigma)。

1.2 PDLSCs體外分離培養(yǎng) 從口腔頜面外科門診獲取患者的健康離體牙8顆，分離培養(yǎng)獲得PDLSCs，培養(yǎng)及鑒定遵循本課題組前期實驗步驟[6]。在超凈工作臺內將拔除后的牙齒經0.01mol/L PBS沖洗5～7次后，自牙冠至牙根方向單向刮取牙根中下1/3部分的牙周膜，修剪組織塊為1mm3大小，Ⅰ型膠原酶消化15min后，離心管內的組織離心800r/min。棄上清后重懸并放置在6孔板中(含15%FBS、100μmol/L抗壞血酸、0.292mg/mL谷氨酰胺、100單位/mL青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基)。在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)5～8d，直至有細胞從組織塊邊緣爬出。細胞生長達80%匯合時用胰酶/EDTA(0.25/0.1，pH=6.4)消化傳代，標記為第一代。采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)分離人正常組織來源的牙周膜干細胞，取第3～4代細胞進行實驗。

1.3 正常及炎癥因子組PDLSCs克隆形成 正常及炎癥因子組PDLSCs消化計數，2000個細胞懸浮于普通培養(yǎng)液接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿，炎癥因子組用含10ng/ml TNFα的普通培養(yǎng)液持續(xù)刺激，3～4d換液，共培養(yǎng)14d。PBS沖洗兩遍后，4%組織細胞固定液固定30min，采用吉姆薩染色試劑盒進行染色30min，后洗去染色液，拍照。

1.4 qPCR檢測正常及炎癥因子組PDLSCs炎癥因子基因表達水平 將PDLSCs消化計數，重懸至1×105個/ml，六孔板每孔加入500ul，補液至2.0ml。待細胞密度至80%，炎癥因子組加入10ng/ml TNFα的培養(yǎng)液刺激24h，用Trizol分別提取各組RNA，測濃度后反轉錄為cDNA，采用Sybr Green試劑盒進行熒光定量PCR檢測，目的基因及管家基因在不同的反應管中進行擴增，反應體系均為20μl。引物序列：GAPDH,上游引物:5′-TCTGACGACTCTGCTTCACG-3′,下游引物:5′-TTCAGGGCATGTGTGATGCT-3′；TNFα，上游引物:CACCACTTCGAAACCTGGGA，下游引物:TGTAGGCCCCAGTGAGTTCT;IL-1β，上游引物：ACCAAACCTCTTCGAGGCAC，下游引物:CGAGCTCAGGTACTTCTGCC。反應條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環(huán)。采用實時熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數據，結果根據標準曲線由軟件自動計算后得出。驗證該方法的重復性和擴增效率。本實驗重復3次。

1.5 qPCR檢測正常及炎癥因子組PDLSCs成骨基因表達水平 將PDLSCs消化計數，重懸至1×105個/ml，六孔板每孔加入500ul，補液至2.0ml。待細胞密度達70%-80%左右時，換成骨誘導液，3天換液，共誘導7天，后Trizol提取各組RNA,具體操作步驟同前。引物序列：Runx2，上游引物：5′-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3′，下游引物： 5′-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3′；ALP，上游引物:5′-ATGTCAACCGAAACGCCTCAG-3′，下游引物:5′-ATGGCGGAGTCGAACATGGCA-3′。反應條件同前。

1.6 qPCR及Western Blot檢測正常及炎癥因子組成骨誘導前后PDLSCs Wnt5a基因及蛋白表達水平 采用qPCR檢測Wnt5a mRNA表達，引物序列：上游引物：5′-TGTTGCTTTCCCGCTTTTCG-3′，下游引物：5′-CCTCTCGGCAGAGGATCAAC-3′。具體條件及步驟同前。將正常組及炎癥因子組成骨誘導前后PDLSCs使用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，調整至相同濃度，制備蛋白樣品。采用Western Blot檢測Wnt5a的蛋白表達水平：配置10%的分離膠、6%的濃縮膠，依據蛋白定量結果進行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min待溴酚藍進入分離膠后調整電壓至120V，電泳60min。隨后將凝膠中的蛋白在轉移電泳槽(200mA，2h)中轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluorid，PVDF)膜。用5%BSA封閉液對PVDF膜封2h，PVDF膜封閉一抗Wnt5a(1∶1000)稀釋，以β-肌動蛋白為內參，4℃過夜。次日取出封有一抗的PVDF膜，復溫1h后TBST洗膜，每次5min，共3次。加入相應濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST洗脫二抗，每次10min，共3次。漂洗膜后加入ECL超敏試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統照相觀察。

1.7 統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；進行多組間比較時，P值進行Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 正常組及炎癥因子組PDLSCs克隆形成率正常組及炎癥因子組PDLSCs接種于大皿，培養(yǎng)14d后鏡下觀均有明顯的克隆形成，克隆中心細胞密集(見圖1)。染色后克隆集落為藍色(見圖1)，正常組克隆形成率為13.91%，炎癥因子組為14.89%，無明顯統計學差異。

圖1 正常組及炎癥因子組PDLSCs接種14d后克隆形成圖片

2.2 正常組及炎癥因子組PDLSCs炎癥因子表達水平 正常組及炎癥因子組PDLSCs在六孔板接種7d后，提取RNA，并進行qPCR檢測TNFα和IL-1β的mRNA表達水平。炎癥因子組TNFα mRNA表達水平是正常組的1.67倍(*P＜0.05)，炎癥因子組IL-1β mRNA表達水平是正常組的1.46倍(*P＜0.05)。炎癥微環(huán)境下，PDLSCs的炎癥因子表達水平增加。

圖2 正常組及炎癥因子組PDLSCs炎癥因子表達水平

2.3 正常組及炎癥因子組PDLSCs成骨基因表達水平 正常及炎癥因子組PDLSCs接種于六孔板，進行14d的成骨誘導后，進行ALP染色。正常組成骨能力較炎癥因子組高，成骨誘導后兩組鏡下觀(圖3B)，均可見成鈣結節(jié)，正常組較炎癥因子組結節(jié)數量多，說明炎癥微環(huán)境下PDLSCs成骨能力較正常組降低。qPCR結果示，常規(guī)培養(yǎng)條件下，炎癥因子組Runx2、ALP mRNA表達水平與正常組無顯著性差異，成骨誘導后兩組成骨基因表達水平均上升，正常組分別是炎癥因子組的1.6倍(*P＜ 0.05)、1.447 倍(*P＜ 0.05)。(圖 3C、D)說明在炎癥微環(huán)境的作用下，PDLSCs成骨能力下降。

2.4 正常組及炎癥因子組PDLSCs成骨誘導前后Wnt5a的表達水平 qPCR結果顯示，常規(guī)培養(yǎng)條件下，炎癥因子組Wnt5a mRNA表達水平是正常組1.88倍(*P＜0.05)，成骨誘導后正常組及炎癥因子組Wnt5a mRNA表達水平分別為常規(guī)培養(yǎng)條件下的 1.27倍(*P＜ 0.05)、1.33倍(*P＜ 0.05)；(圖4A)Western Blot結果示，炎癥因子組Wnt5a蛋白表達水平增加，成骨誘導后兩組Wnt5a蛋白表達水平均增加，炎癥因子組高于正常組。(圖4B)Wnt5a蛋白表達量灰度分析結果示，正常組diff、炎癥因子組undiff、炎癥因子組diff分別為正常組undiff的1.2709倍、1.8246倍、2.2176倍。(圖4C)炎癥微環(huán)境下Wnt5a的表達水平增加，且成骨誘導后Wnt5a的表達水平也增加，說明Wnt5a可能在PDLSCs炎癥發(fā)生發(fā)展及成骨破骨平衡過程中發(fā)揮重要的作用。

圖3 正常組及炎癥因子組PDLSCs ALP染色大體觀、鏡下觀(×200)及成骨基因表達水平

圖4 正常及炎癥因子組PDLSCs成骨誘導前后Wnt5a mRNA及蛋白表達水平

3.討論

干細胞具有多向分化能力、低免疫原性等優(yōu)點，在組織工程中具有廣闊的應用前景。Kawaguchi H等研究發(fā)現在III級犬類實驗缺陷中，自體骨髓間充質干細胞移植可以促進到20%的牙骨質和牙槽骨再生[7]。但臨床應用中，骨髓間充質干細胞取材存在一定的困難。PDLSCs具有干細胞的共有特性，且取材方便，是組織工程研究的熱點。有研究者采用PDLSCs復合纖維膜片技術用于牙再植，取得了較好的臨床效果[8]。慢性炎癥微環(huán)境下，PDLSCs增殖能力增強，但是成骨分化能力較弱，組織修復能力減弱[3]。Wnt通路分為經典通路Wnt通路和非經典Wnt/Ca2+通路，Wnt/β-catenin(β-連環(huán)蛋白)經典通路與TCF/LEF家族形成復合體，主要調控干細胞增殖[9]。而非經典Wnt/Ca2+通路與干細胞的成骨分化正相關。X Chen課題組研究表明在炎癥微環(huán)境下NFkB通過與β-catenin的競爭來調節(jié)PDLSCs的成骨分化[10]。

我們的結果表明，炎癥微環(huán)境下PDLSCs炎癥因子TNFα、IL-1β的表達水平是增加的。大量研究發(fā)現，慢性炎癥牙周組織中存在的大量的促炎性細胞因子(TNFα、IL-1β等)，參與牙周組織免疫反應及破骨細胞分化，TNFα和IFNγ可通過Fas-FasL途徑調控間充質干細胞介導的組織再生[11]。成骨誘導后兩組成骨基因Runx2、ALP mRNA的表達水平均增加，但是炎癥因子組較正常組較低，說明慢性炎癥微環(huán)境下，由于炎癥因子的存在干擾了牙周組織的成骨破骨平衡，從而導致牙槽骨的破壞與吸收。Wnt5a是巨噬細胞分泌的一種新型的炎性介質，通過自分泌或者旁分泌的方式參與炎癥反應。在類風濕性關節(jié)炎的體內均檢測到wnt5a呈高表達狀態(tài)[12，13]。Blumenthal等發(fā)現 Wnt5a 基因在微生物或其組分刺激下表達持續(xù)上調，且Wnt5a的表達上調需要Toll-樣受體(TLR)及核因子 -κβ(NF-κβ)的活化[14]，表明 Wnt5a 及其受體FZD5共同參與了機體的抗炎癥反應。sFRP5和Wnt5a在牙周健康和疾病中表達之間的新型互惠關系，使Wnt5a/sFRP5比例具有作為牙周炎生物標志物的可能性。

在牙周炎中Wnt5a扮演怎樣的角色呢？有研究者對20例慢性牙周炎患者牙齦取材，進行qPCR及Western Blot檢測，結果示慢性牙周炎患者的炎癥性牙齦組織中Wnt5a的表達水平顯著高于正常牙齦組織(P＜0.05),附著喪失的程度與牙周炎患者牙齦組織中Wnt5a的表達呈高度正相關[15]。2008年Pereira C等研究表明Wnt5a/CaMKⅡ通路參與了炎癥反應，并且提出Wnt5a可能調控了該通路[16]。

我們的qPCR結果示，常規(guī)培養(yǎng)條件下，炎癥因子組Wnt5a mRNA表達水平是正常組1.88倍(*P＜0.05)，成骨誘導后正常組及炎癥因子組Wnt5a mRNA表達水平分別為常規(guī)培養(yǎng)條件下的1.27倍(*P＜ 0.05)、1.33倍(*P＜ 0.05)；Western Blot結果示，Wnt5a蛋白表達量Western Blot結果灰度分析結果，正常組diff、炎癥因子組undiff、炎癥因子組diff分別為正常組undiff的1.2709倍、1.8246倍、2.2176倍。炎癥因子組Wnt5a蛋白表達水平增加，成骨誘導后兩組Wnt5a蛋白表達水平均增加，炎癥因子組高于正常組。而Wnt5a與破骨細胞的形成息息相關，為何在成骨誘導后表達增加？我們推測可能是因為在成骨誘導的條件下，成骨增加，相應的破骨也增加。炎癥微環(huán)境下Wnt5a的表達水平增加，且成骨誘導后Wnt5a的表達水平也增加，說明Wnt5a可能在PDLSCs炎癥發(fā)生發(fā)展及成骨分化過程中均發(fā)揮重要的作用。有學者研究結果表明，活化的NLK可以磷酸化TCF，阻止β-catenin-TCF復合體與DNA結合，并且Wnt5a和Rfz-2均可刺激Ca2+釋放并活化CaMKII[17，18]。非經典Wnt-5a/Ca2+通路通過激活TAK1-NLK MAPK級聯，拮抗典型Wnt/-catenin信號。Wnt5a作為一個重要的前炎癥因子，能夠在不同的細胞類型中產生炎癥效應[19-20]。

Wnt5a在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用及具體機制，我們將進行進一步探究。