史嘯坤，楚 晨*

（1．哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、哈爾濱師范大學(xué)附屬中學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150080；2．哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080）

基因組印記是經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，常表現(xiàn)為父源或母源一方的等位基因表達(dá)，而另一方的等位基因沉默。之前的研究表明，在這樣的印記基因簇中，總分布著一些差異甲基化區(qū)，即父本和母本具有不同甲基化狀態(tài)的區(qū)域，且這些差異甲基化區(qū)對(duì)印記基因的調(diào)控有重要的作用[1]。

DLK1-DIO3印記區(qū)間位于人14號(hào)染色體、小鼠12號(hào)染色體上，在兩者的表達(dá)中高度保守，其間有三個(gè)父本控制的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，以及多個(gè)母本控制的非編碼轉(zhuǎn)錄本，還有大量的C/D snoRNA和microRNA。其間有三個(gè)差異甲基化區(qū)，分別為父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR，以及母本甲基化的MEG8-DMR[2]。

之前的研究表明，在MEG8-DMR的上游和下游分別定點(diǎn)整合和插入AAV腺病毒載體和Sleeping Beauty 睡美人轉(zhuǎn)座子會(huì)促進(jìn)肝癌的發(fā)生[3-4]，DLK1-DIO3印記區(qū)間中的DLK1、RTL1、MEG3以及microRNA也與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。因此，探究差異甲基化區(qū)MEG8-DMR對(duì)腫瘤發(fā)生的影響以及其調(diào)控機(jī)制，深入分析印記基因參與腫瘤的發(fā)病機(jī)理，無(wú)疑具有重要的意義。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新方法。CRISPR/Cas9來(lái)源于簡(jiǎn)單的細(xì)菌免疫系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)人為改造后，可在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯[6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物細(xì)菌酵母魚(yú)類以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肝癌Huh7細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存；CRISPR/Cas9質(zhì)粒骨架載體為本實(shí)驗(yàn)室改造后的pX458載體；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000 Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；進(jìn)口胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；青鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司；嘌呤霉素購(gòu)自Sigma公司；RNAiso Plus、SYBR?Green PCR Master Mix、PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；MTT粉末購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMSO購(gòu)自Sigma公司。

1.2 重組載體的構(gòu)建以及sgRNA的設(shè)計(jì)

1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)

在網(wǎng)站http://crispr.dbcls.jp/中輸入欲敲除的片段，根據(jù)網(wǎng)站給出的結(jié)果，依據(jù)脫靶位點(diǎn)少的原則，選擇sgRNA-F和sgRNA-R，即紅色三角形所示位置，從而對(duì)MEG8-DMR進(jìn)行敲除。

圖1 MEG8-DMR區(qū)域基因組結(jié)構(gòu)sgRNA靶位點(diǎn)定位示意圖

1.2.2 構(gòu)建重組載體及重組載體的轉(zhuǎn)染

在本實(shí)驗(yàn)原有的pX458質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，首先分別用限制性核酸內(nèi)切酶Bbs1與Bsa1對(duì)其進(jìn)行切割，再將sgRNA-F和sgRNA-R連入酶切位點(diǎn)，通過(guò)脂質(zhì)體法，使用Lipo2000，利用細(xì)胞膜的電性與Lipo2000相互吸引，進(jìn)而將重組載體傳染入人肝癌Huh7細(xì)胞。

圖2 實(shí)驗(yàn)室中所用的pX458質(zhì)粒示意圖

1.3 目的克隆的篩選

1.3.1 藥物篩選

轉(zhuǎn)染24 h～48 h后，鑒于載體本身攜帶的Puro篩選標(biāo)簽，加入含有嘌呤霉素的培養(yǎng)液，Huh7藥篩濃度為2.5 ug/mL。藥篩三天后，有限稀釋法重新鋪于96孔板中，對(duì)所獲得單個(gè)克隆進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 PCR檢測(cè)

利用酚氯仿法，提取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞的基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)顯示有目的條帶的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收，然后進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步分析其敲除情況，敲除鑒定引物，見(jiàn)表1。

表1 敲除鑒定引物及定量檢測(cè)引物序列

1.4 檢測(cè)Huh7細(xì)胞中DLK1表達(dá)水平變化

1.4.1 DLK1表達(dá)水平檢測(cè)

通過(guò)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DLK1基因在mRNA水平表達(dá)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 重組載體成功轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞

根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)，可以看出重組載體成功轉(zhuǎn)染入人肝癌Huh7細(xì)胞。

圖3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞24 h后轉(zhuǎn)染效果圖（10X）

2.2 單克隆篩選鑒定

通過(guò)測(cè)序比對(duì)基因組敲除情況，對(duì)野生型細(xì)胞、E5號(hào)克隆、B7號(hào)克隆進(jìn)行基因組PCR鑒定，野生型條帶大小為1528 bp。電泳顯示E5號(hào)克隆在約350 bp處可見(jiàn)敲除帶。

測(cè)序比對(duì)顯示，重組載體在上游靶位點(diǎn)附近和下游靶位點(diǎn)外行使對(duì)MEG8-DMR敲除效應(yīng)，成功敲除1190 bp，兩敲除位點(diǎn)10 bp內(nèi)存在一定的堿基修復(fù)差異。E5號(hào)克隆確定為本研究實(shí)驗(yàn)組目的克隆細(xì)胞株。

圖4 PCR檢測(cè)所得克隆基因組敲除結(jié)果

2.3 細(xì)胞形態(tài)比對(duì)

將野生型細(xì)胞和E5號(hào)克隆進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)比較，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯變化。

圖5 野生型Huh7細(xì)胞與E5號(hào)克隆細(xì)胞形態(tài)比對(duì)（20X）

2.4 實(shí)時(shí)定量分析DLK1的表達(dá)變化

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)野生型Huh7細(xì)胞和E5號(hào)克隆DLK1表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)E5號(hào)克隆mRNA的表達(dá)與野生型細(xì)胞相比明顯較低。

圖6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)野生型Huh7細(xì)胞和E5號(hào)克隆DLK1表達(dá)水平變化**P＜0.01

3 結(jié) 論

（1）重組載體可在Huh7細(xì)胞系中對(duì)MEG8-DMR區(qū)域進(jìn)行有效敲除。（2）敲除MEG8-DMR后細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯變化。（3）敲除MEG8-DMR導(dǎo)致上游基因DLK1表達(dá)水平的下調(diào)。

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)MEG8-DMR的敲除，導(dǎo)致DLK1表達(dá)下調(diào)，而DLK1在幾種腫瘤包括神經(jīng)纖維瘤、骨髓增生異常綜合征和肝癌患者的血清中呈高表達(dá)[7]，且腫瘤的形成是多因素、多基因共同參與的結(jié)果， MEG8-DMR上下游區(qū)域分布著一系列母系表達(dá)非編碼轉(zhuǎn)錄本，和大量的miRNA和C/D snoRNA，因此，MEG8-DMR及臨近基因在肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生過(guò)程中可能具有表達(dá)調(diào)控的功能，有待于進(jìn)一步進(jìn)行研究。